[發明專利]植物根內生防細菌的快速、高效篩選方法

無效

• 申請號: 200710056057.3
• 申請日: 2007-09-11
• 公開（公告）號: CN101148647A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 李春杰;許艷麗;馬光波
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 長春科宇專利代理有限責任公司
• 代理人: 楊恕平

1.一種植物根內生防細菌的高效篩選方法，其特征在于采用改進的TY培養基，稀釋平板法分離細菌，在另一Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不同的10個細菌菌落進行培養，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現，有抑菌帶出現的即為目標細菌；其方法及具體步驟如下：

a.細菌分離

取約0.1g植物干根，至于表面用酒精消毒的研缽中，加入MgSO₄緩沖液，將根樣研磨成勻漿，準備三支試管分別裝入0.9ml?MgSO₄緩沖液并配制成10^-2、10^-3、10^-4的稀釋液和三個TY平板，培養皿背面標好日期和稀釋度10^-2、10^-3、10^-4，分別從三支試管中取稀釋液置于一TY平板上，依次作三個平板，將三角玻璃棒浸入酒精中稍許，于酒精燈上燃燒，重復兩次，用酒精消毒的三角玻璃棒涂勻TY平板，先涂10^-4，再涂10^-3，最后涂10^-2，該過程三角玻璃棒不用反復消毒，將所有的平板于28℃細菌培養箱中培養；

b.生防細菌初篩

配制病原真菌懸浮液，取病原真菌懸浮液均勻地涂在Ch+TY平板上，用已滅菌的接菌棒挑出每個培養皿形狀、大小和顏色不同的10個細菌菌落，接種于已涂真菌孢子懸浮液的Ch+TY平板上，但個別生長特快的細菌只能一個Ch+TY平板上接種一個細菌菌落，于25℃真菌培養箱中培養，培養2-3天，發現有的細菌周圍出現抑菌帶(不長真菌)或菌絲長得較短、產生較少孢子或沒有孢子產生，即為目標細菌；

c.純化

用已滅過菌的接菌棒挑出目標細菌，于另一Ch+TY平板上劃線純化，并且劃8-10條線，換另一個無菌棒，以上一條線為起點繼續劃線，于28℃細菌培養箱中培養，一天即可觀察，如果發現仍有形狀、大小和顏色不同的細菌菌落，則需分別挑取繼續純化，直至每皿呈現形狀、大小和顏色均相同的菌落；

d.復篩

將已純化的細菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對峙培養，或于Ch+TY平板中心點接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點接入細菌，于25℃真菌培養箱中培養，2-3天可測定抑菌帶寬，計算抑菌率；

e.生防菌保存

將生防細菌接入直徑為4cm的Ch+TY培養皿中心，或試管斜面劃蛇形線，28℃培養一天后，用封口膜封好，4℃保存，備用。