[發明專利]區分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切位點

無效

• 申請號: 200710056023.4
• 申請日: 2007-08-31
• 公開（公告）號: CN101376909A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發明（設計）人: 王鳳雪;閆喜軍;吳威;柴秀麗;張海玲;羅國良;邵西群
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 王薇

技術領域：

本發明涉及一種區分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列和一個酶切 位點，是融合反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和限制性內切酶分析(RFLP) 兩種常規分子生物學鑒定檢測方法的發明，選擇特異的核酸片段和一種限制 性內切酶，有效地鑒別犬瘟熱病毒的接種疫苗株和感染野毒株。

背景技術：

中和試驗、免疫熒光抗體技術、酶聯免疫吸附測定等方法已經在犬瘟熱 的診斷中發揮了作用。另外，電鏡診斷法與上述方法相比較，其檢出率有顯 著的一致性。雖然上述方法取得了一定的效果，但有的耗時較長，有的敏感 性、特異性或準確性較差，不能及時確診。近年來，隨著核酸雜交、PCR等技 術的應用，犬瘟熱的診斷也進入了分子生物學階段。核酸探針、原位雜交、 RT-PCR以及基因序列分析等方法建立之后，就可對病料中是否含有CDV特異 性核酸進行鑒定，從而提高了犬瘟熱診斷的準確性、敏感性和特異性。盡管 目前犬瘟熱疫苗滅活苗可以保護大多數免疫動物不被感染發病，但也存在野 毒感染發病的危險。由于疫苗在動物體內存在一定的半衰期，臨床上發病初 期檢測疫苗免疫動物時，檢測到的犬瘟熱病毒是疫苗殘存還是感染野毒，還 難以確定，從而沒有更好的治療和綜合防治措施。因此，區分疫苗株和野毒 株就顯得尤為重要。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種區分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一段序列 和一個酶切位點，有效區分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株，為毛皮動物的養殖 提供獸醫技術保證。

本發明的技術方案是這樣實現的：區分犬瘟熱病毒疫苗株和野毒株的一 段序列和一個酶切位點，其特征在于：在CDV犬瘟熱結構蛋白核蛋白NP基因 的372-1200位之間，設計引物(P1：5‘TTCTG?AGGCA?GATGA?GTTCT?TC3’， P2：5‘CTTGG?ATGCT?ATTTC?TGACA?CT3’)RT-PCR擴增特異性片段829bp， 并進行BamHI?RFLP分析，可以通過擴增片段的酶切圖譜的條帶數目來確定所 檢測到的CDV屬于疫苗株還是野毒株；酶切NP基因目的片段，瓊脂糖凝膠電 泳得到675bp和153bp2條帶者為疫苗株，得到455bp、220bp和153bp3條 帶者為野毒株。

本發明的積極效果是：鑒定方法簡單，準確率和效率都很高；河北肅寧 某狐貍養殖場送檢的發病狐貍，我們檢測犬瘟熱陽性，利用該方法擴增到目 的片段829bp片段，并進行RFLP分析，得出該場狐貍感染了野毒，此過程在 6個小時內完成。建議他們隔離發病動物，緊急接種犬瘟熱疫苗，病情得到了 很好控制。后來我們進一步用核酸測序的方法驗證該擴增序列確實為CDV?NP 基因中我們選擇的目的序列，并且在預計位點處有預期分析的酶切位點。現 在已經有此種實例23例，其中5個國內外使用的疫苗株，18個不同地區臨床 感染野毒實例。選擇5個疫苗株及有代表性的5個野毒株列舉測序結果，見 序列表。根據我們選擇的序列和酶切位點，可在送檢病料當天6小時內得出 結果，確定動物體內檢測到的犬瘟熱病毒類型。

附圖說明：

圖1為區別犬瘟熱疫苗株和野毒株的擴增片段電泳圖，野毒株來自 2005-2007年間收集的部分犬瘟熱陽性組織病料，疫苗株為收集的國內外臨床 上使用的疫苗株；1、19為100bp?Ladder?DNA?Marker；2～14為擴增病料結 果，其中2、3、4、5、7、9、12為犬瘟熱陽性；15～18為收集的國內外犬瘟 熱疫苗株擴增條帶。

圖2為區別犬瘟熱疫苗株和野毒株的擴增片段的酶切鑒定電泳圖，M為 100bp?Ladder?DNA?Marker；1～4為發病臟器中擴增的829bp目的片段RFLP 分析結果，得到3條帶：455bp、220bp和153bp，屬于CDV野毒株；5～8 為收集的幾種國內外犬瘟熱疫苗株擴增的目的產物RFLP分析結果，得到2 條帶：675bp和153bp。

具體實施方式：

下面實施例對本發明做進一步的描述：

實施例1：

1、引物的設計與合成：

設計合成一對引物P1：5‘TTCTG?AGGCA?GATGA?GTTCT?TC3’，P2：5‘CTTGG ATGCT?ATTTC?TGACA?CT3’，預期擴增目的片段大小為829bp。將特產研究所 疫苗株CDV3株中CDV?NP基因829片段擴增。