[發明專利]一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 200710055710.4
• 申請日: 2007-05-31
• 公開（公告）號: CN101096663A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發明（設計）人: 王曉平;王擁軍;郝東云;張同海;張今;張雷;曲和之;黃露;杜珊珊
• 申請（專利權）人: 王曉平;王擁軍
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 魏征驥

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及利用生物技術從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶(SOD)。

背景技術

無花果：英文名Fig，學名Ficus?carica?L。為桑科(Moraceae)榕屬(Ficus?L.)多年生亞熱帶落葉果樹，小喬木或灌木。又稱壽果、明日果、蜜果，原產于地中海沿岸的西亞沙特阿拉伯、也門一帶沙漠綠洲里，是人類最早栽培的果樹之一。無花果葉含有黃酮、果膠、樹脂、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、蛇麻脂醇、棕櫚酸、纈草酸、愈瘡木酚、廿八烷、蕓香苷、苯甲醛、呋喃香豆素，補骨脂素，佛手柑內酯，其中某些被認為是抗癌活性成分。

超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase，SOD，EC?1.15.11)是一種金屬酶，分子量為31000-33000，由兩個亞基組成。SOD廣泛存在于生物細胞內和植物葉綠體基質中。

1938年Mann和Keilin首次從牛血紅細胞中分離出一種藍色的含銅蛋白(Hemocuprein)；1969年McCord和Fridovich發現這種含銅蛋白能催化超氧陰離子自由基(O₂^-·)發生歧化反應，將其命名為超氧化物歧化酶(Superoxide?dismutase，SOD)。SOD是生物體內超氧自由基的專一清除劑，能清除人體內產生的超氧陰離子自由基(O₂^-·)，消除活性氧毒性，在生物體內自由基產生與消除的動態平衡中起著重要作用，是生物體內一種重要的防御酶。由于具有巨大的藥用價值和廣闊的應用前景，多年來對SOD的研究與應用一直受到科學界和企業界的極大關注。

SOD的基礎和應用研究進展十分迅速，并已進行了臨床試驗。其臨床應用主要集中在抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老及皮膚病、心血管病等疾病的預防和治療。隨著研究工作的不斷深入，SOD的應用也越來越廣泛，國外已有專利生產SOD消炎藥、含SOD的化妝品、抗輻射SOD膠囊、治療局部缺血癥SOD藥劑等。美國、日本及西歐一些國家開發的重組人SOD藥物，已經進行入II期和III期臨床研究。我國也開展了基因重組SOD的研究。

目前從植物中提取SOD的工藝流程：植物組織或器官→組織破碎，鹽溶液提取→離心收集上清液→硫酸銨分級沉淀→收集沉淀→水或緩沖液溶解→丙酮沉淀→pH7.8磷酸鉀緩沖液溶解→離心除去不溶雜蛋白→透析→Biogel?P-60柱層析→收集活力組分→硫酸銨沉淀→pH7.8磷酸鉀緩沖液溶解，透析→DE-32柱層析→收集活力組分→DE-32柱層析→收集活力組分，濃縮得到SOD成品

相關資料表明，國內外有關SOD分離提取工藝中均采用乙醇、丙酮有機溶劑。若大規摸生產SOD，需回收乙醇、丙酮等有機溶劑，不僅浪費人力物力，而且有機溶劑易燃易爆，用于工業生產將有重大的安全隱患。

發明內容

本發明提供一種從無花果樹樹葉中提取超氧化物歧化酶的方法，從而可解決現有生產方法中采用有機溶劑提取導致生產成本高，需回收乙醇、丙酮等有機溶劑，浪費人力物力，及有機溶劑易燃易爆，用于工業生產將有重大安全隱患等一系列問題。以無花果樹樹葉為原料，采用無有機溶劑提取超氧化物歧化酶的方法未見有文獻報到。本發明采取的技術方案是：包括下列步驟

一、抽提

選新鮮或低溫保鮮的無花果樹樹葉100克，清洗，加入500～1000mL含0.1～0.5mM?EDTA/0.1～0.5％甘油0.01～0.05％β-巰基乙醇、pH7.8的磷酸鈉緩沖液，勻漿，抽提1～2小時，除渣過濾，5000～8000rpm離心10min；

二、鹽析

向上清液中加入固體硫酸銨至40％飽和度，8000～10000rpm離心10min，向上清中補加硫酸銨至85％飽和度，靜置1～2小時，8000～10000rpm離心10～20min。沉淀用50～80ml的5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解，并在4℃下對該緩沖液透析40～60小時，8000～10000rpm離心5～10min，收集上清液；

三、陰離子交換層析

將上清液加入經5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液平衡的DEAE-Sepharose?Fast?Flow陰離子交換柱，用5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液洗脫未結合的蛋白，采用5～10mM，pH7.8的磷酸鈉緩沖液含0.1～0.2M的氯化鈉洗脫目的蛋白，以紫外檢測并收集蛋白峰，同時檢測其酶活性，合并活性峰，凍干濃縮至3～5ml；