[發明專利]農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200710055569.8
• 申請日: 2007-04-25
• 公開（公告）號: CN101063149A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 劉立俠;李望豐;王德利;賈廣和;金太成;申玉華;常青;馬強;殷東旭;許守民
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/87;A01H4/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所
• 代理人: 趙軍;劉延軍

1.農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化方法，其特征是應用超聲輔助農桿菌介導苜蓿下胚軸遺傳轉化方法：

應用材料：

1)苜蓿種子為公主嶺1號；

2)菌株和質粒：農桿菌菌株LBA4404和轉化載體pBI121均購自北京鼎國生物技術有限公司；含有目的基因：堿蓬的Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因SsNHX1的轉化載體pBI121由東北師范大學生命科學學院保存和構建，能夠公開獲得；

具體步驟如下：

1)苜蓿種子首先要經過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞，用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌種子接種到成份為Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的發芽培養基中，在25℃條件下，弱光培養1天；

2)待下胚軸長出時用手術刀將其切下，大約長度為0.5毫米左右，然后將下胚軸接種到成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的固體誘導培養基中培養20-30天，當愈傷組織生長成組織密實、顏色淺綠時為宜；

3)將合適的愈傷組織接種到成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8的液體誘導培養基中懸浮培養，每間隔5-7天換一次新鮮的培養基，搖床轉速維持在150轉為宜，需要適當補充光照，20-30天時，大量的、均一的胚性愈傷組織生長成熟；

4)在含有目的基因的農桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養基中，過夜培養，再取1毫升轉到50毫升的YEB液體培養基中培養，待生長到光密度值為0.6左右時，離心4000轉，10分鐘，收集菌體，待用；?

5)收集菌體用成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升，pH5.8共培養液體培養基50毫升重懸兩次；

6)將胚性愈傷組織10個為一批裝到2.0毫升的小離心管中，管中盛有成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升，pH5.8，600微升的共培養液體培養基，將裝有胚性愈傷組織的小離心管放到超聲儀中，參數為100mHz處理8秒鐘，然后，快速將管中的液體培養基吸出，迅速加入1毫升的農桿菌重懸液，侵染30分鐘；

7)將浸染過的胚性愈傷組織平放在成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升+0.4％瓊脂，pH5.8的半固體共培養基中暗培養3-5天，溫度為25℃；

8)將共培養后的胚性愈傷組織接種到成份為Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA?0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的分化培養基培養50-60天，胚性愈傷組織經過四個胚期生長成成熟的體胚，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養基；

9)將成熟的體胚外植體再轉入成份為Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8的萌發培養基中萌發，培養條件為25℃，18∶6光周期，20-30天，體胚生長出完整的轉化植株，當植株長到10厘米左右時煉苗移栽。

2.農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化方法，其特征是農桿菌介導的苜蓿真葉遺傳轉化方法：應用材料：

1)苜蓿種子為公主嶺1號；

2)菌株和質粒：農桿菌菌株LBA4404和轉化載體pBI121均購自北京鼎國生物技術有限公司；含有目的基因：堿蓬的Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白基因SsNHX1的轉化載體pBI121由東北師范大學生命科學學院保存和構建，能夠公開獲得；

具體步驟如下：?

1)苜蓿種子首先要經過細砂紙打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡處理10分鐘，倒掉酒精后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1％升汞處理20分鐘，倒掉升汞，用無菌水沖洗5-6次，最后將無菌的種子接種到成份為Ms鹽+3.0％蔗糖+0.58％瓊脂，pH5.8的發芽培養基中，在25℃條件下，培養4-5天，真葉剛剛展開為宜；

2)在含有目的基因的農桿菌LBA4404平板中挑取單菌落接種到3毫升YEB液體培養基中，過夜培養，再取1毫升轉到50毫升的YEB液體培養基中培養，待生長到光密度值為0.6時，離心4000轉，10分鐘，收集菌體，待用；

3)收集菌體用成份為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升，pH5.8的共培養液體培養基50毫升重懸兩次，然后用共培養液體培養基將農桿菌稀釋3倍；

4)用剪刀將真葉剪下來，然后將真葉侵染到農桿菌中，侵染30分鐘，然后，將侵染過的真葉的遠軸面放在成分為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩爾/升，0.4％瓊脂，pH5.8的半固體共培養基中暗培養3-5天，溫度為25℃；

5)將共培養后的真葉接種到含有抗生素的成分為Ms鹽+UM有機+水解酪蛋白2克+2.4-D?2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升+卡那霉素30毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的愈傷培養基培養50-60天后，抗性愈傷組織誘導出來，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養基；

6)將抗性愈傷組織接種到成分為Ms鹽+NAA0.05毫克/升+6-BA?0.5毫克/升+3.0％蔗糖+頭孢霉素300毫克/升，0.58％瓊脂，pH5.8的分化培養基培養50-60天，胚性愈傷組織經過四個胚期生長成成熟的體胚，在此期間每隔20天換一次新鮮的培養基；

7)將成熟的體胚外植體再轉入成分為Ms鹽+頭孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58瓊脂，pH5.8的萌發培養基中萌發，培養條件為25℃，18∶6光周期，20-30天，體胚生長出完整的轉化植株，當植株長到10厘米時煉苗移栽。?