[發明專利]農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200710055569.8
• 申請日: 2007-04-25
• 公開（公告）號: CN101063149A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 劉立俠;李望豐;王德利;賈廣和;金太成;申玉華;常青;馬強;殷東旭;許守民
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/87;A01H4/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所
• 代理人: 趙軍;劉延軍

技術領域

本發明屬于植物轉基因技術領域，具體涉及苜蓿遺傳轉化方法

背景技術

苜蓿的遺傳轉化研究盡管已經開展了二十多年，但是，建立高效穩定的遺傳轉化體系一直是制約轉基因苜蓿研究和應用的重要因素。在苜蓿的遺傳轉化中，體胚發生途徑是苜蓿再生的主要途徑。目前，報道的轉基因苜蓿主要通過該途徑獲得，如Mckersied等(1996)年將Mn-SOD基因應用體胚轉化途徑轉化了苜蓿獲得了耐旱的苜蓿。Winicov等(1999)年應用體胚轉化途徑成功將Alfin1轉錄因子整合到苜蓿基因組中，獲得了耐鹽堿苜蓿。體胚再生途徑有很多優點，如體胚分化數量大，可以獲得大量的轉化材料。其次，轉化材料中形成嵌合體的幾率小，減少后代的篩選純化工作量。而且，體胚對于抗生素比較敏感，發生抗生素篩選逃逸的材料少等。但是，體胚發生途徑也有其一定的弊端，比如體胚發生途徑周期長，體胚培養程序復雜，不易掌握，體胚生長狀態不均一，高濃度的抗生素嚴重抑制體胚的發育等。總的來說，體胚發生途徑還是適用于苜蓿的遺傳轉化工作的。體胚發生途徑的外植體來源主要包括子葉、真葉和下胚軸等，其中下胚軸和真葉的分化效率最好。研究表明，下胚軸不適合作為農桿菌的直接侵染受體，而下胚軸來源的胚性愈傷組織可以做為農桿菌侵染的優良受體；苜蓿的真葉因其組織體較大，能夠對農桿菌有著較強的耐受能力，并且幼嫩的真葉又有較強的分化能力，所以，真葉也是一種優良受體。

發明內容

本發明主要目的是克服苜蓿轉化頻率低和周期長等制約苜蓿遺傳轉化效率的技術難題，提高苜蓿的遺傳轉化效率和縮短遺傳轉化周期。建立了兩種苜蓿遺傳轉化方法，第一種是超聲輔助農桿菌介導轉化苜蓿下胚軸胚性愈傷的遺傳轉化方法，即以苜蓿下胚軸誘導的愈傷組織經過懸浮培養方式，獲得高產和生長狀態均一的苜蓿胚性愈傷作為轉化受體材料，再應用超聲輔助農桿菌介導轉化胚性愈傷材料，然后在含有抗生素的分化培養基中篩選到具有抗性的體胚，由體胚萌發、發芽、生根，最后獲得轉化植株。第二種是農桿菌介導轉化苜蓿幼嫩真葉遺傳轉化方法，即以苜蓿幼嫩的真葉作為轉化受體材料，用農桿菌介導直接轉化真葉，侵染過的真葉在含有抗生素的愈傷誘導培養基中篩選到具有抗性的愈傷組織，然后，將抗性愈傷組織接種到不含有抗生素的分化培養基中誘導出體胚，體胚萌發、發芽、生根，最后獲得轉化植株。

本發明技術方案是：

1.應用超聲輔助農桿菌介導轉化苜蓿下胚軸胚性愈傷的遺傳轉化方法：

1)以苜蓿下胚軸為外植體，在固體誘導培養基中誘導出愈傷組織，然后將愈傷組織接種到液體誘導愈傷培養基中懸浮培養，誘導出大量的和均一的胚性愈傷；

2)以超聲輔助農桿菌介導苜蓿的胚性愈傷，在含有抗生素的分化培養基中篩選到具有抗性的體胚；

3)體胚在萌發培養基中萌發出轉化植株；

4)PCR和Southern?blot方法檢測轉基因苜蓿植株。

2.農桿菌介導苜蓿幼嫩真葉遺傳轉化方法

1)以苜蓿幼嫩的真葉為外植體，農桿菌介導轉化真葉，然后在含有抗生素的固體愈傷培養基中誘導出抗性愈傷組織；

2)將抗性愈傷組織接種到不含有抗生素的分化培養基中誘導出成熟的體胚；

3)體胚在萌發培養基中萌發出轉化植株；

4)PCR和Southern?blot方法檢測轉基因苜蓿植株。

本發明以苜蓿下胚軸為轉化受體，在固體培養基中誘導出愈傷組織，然后將愈傷組織接種到液體培養基中，懸浮培養出大量的、均一的胚性愈傷組織，再以該組織作為轉化受體，以超聲輔助農桿菌介導轉化該受體。該方法克服了固體培養基培養下胚軸時獲得的胚性愈傷不均一的弊端，也顯著的提高了苜蓿的遺傳轉化效率，在超聲輔助農桿菌介導轉化中，瞬時轉化效率可以達到46％，穩定表達效率可以達到15.4％。此外，該方法也顯著縮短了苜蓿體胚轉化周期，應用常規的直接轉化下胚軸愈傷組織獲得轉化苗大約需要7-8個月的時間，而采用本發明的方法需要為5-6個月，即可以獲得大量的轉化植株。

本發明以苜蓿真葉為轉化受體，經過農桿菌侵染后的真葉在含有較低濃度抗生素的愈傷培養基中誘導出愈傷組織，然后，將愈傷組織轉到撤掉抗生素的分化培養基中進行分化。該方法適度的降低了愈傷培養基中的抗生素濃度，縮短了抗性愈傷組織的誘導周期，獲得的抗性愈傷組織在不含抗生素的分化培養基中能夠很快的分化出體胚來，這使常規的真葉遺傳轉化周期的7-8個月縮短為5-6個月，而且，真葉的遺傳轉化效率也高達13.5％。

具體實施方式

實施例1：

應用超聲輔助農桿菌介導苜蓿下胚軸遺傳轉化方法

1材料：