[發(fā)明專利]在體外用ELISA方法建立的IL－6/sIL－6R結合的分子模型

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710053142.4
• 申請日: 2007-09-06
• 公開（公告）號: CN101246160A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設計）人: 劉朝奇;王艷林;鄒坤;柳長柏;韓鈺;楊凡;柳發(fā)勇;高明星;史繼靜;楊祖?zhèn)?/a>
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/15
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 馬輝

1.一種在體外用ELISA方法建立的人IL-6/sIL-6R結合的分子 模型，其特征是：經(jīng)過原核表達的人IL-6與其受體人sIL-6R特異性 結合形成具有生物學活性的IL-6/sIL-6R復合物，所述分子模型的優(yōu) 化條件為：包被人sIL-6R?1∶500；人IL-61∶1000；人IL-6抗體1∶ 2000，分子模型的建立步驟為：

(1)、用包被液稀釋人sIL-6R至所需濃度1∶500，然后包被于 96孔板內(nèi)，100uL/孔，用透明膠封閉后放入4℃冰箱過夜；

(2)、PBST洗三次，再用1％BSA封閉，300uL/孔，37℃，1 小時；

(3)、用PBST洗三次，用1％BSA稀釋人IL-6至所需濃度1∶ 1000，100uL/孔，室溫2小時；

(4)、用PBST洗三次，用1％BSA稀釋人IL-6抗體至所需濃度 1∶2000，100uL/孔，37℃，1小時；

(5)、用PBST洗三次，加酶標羊抗兔抗體，1∶10000稀釋，100uL/ 孔，37℃，1小時；

(6)、TMB顯色，100uL/孔，10min；

(7)、終止反應，50uL/孔、2M?H₂SO₄；

其中所述的原核表達的人IL-6是通過下述方法表達得到的：

(1)、用經(jīng)過RT-PCR擴增的人IL-6cDNA片段與原核表達載體 pET28a(+)連接，轉(zhuǎn)入宿主細胞，建立表達載體；

(2)、將正確構建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21中進行誘導表達 和SDS-PAGE電泳，選取表達量最高的菌作為原始菌種保存?zhèn)溆茫?

(3)、將原始菌種進行培養(yǎng)，提取包涵體；

其中所述的原核表達的人sIL-6R是通過下述方法表達得到的：

(1)、選擇人sIL-6R的胞外區(qū)片段設計相應引物，以人PBMC? cDNA為模板，PCR方法擴增sIL-6R基因，用經(jīng)過RT-PCR擴增的 人sIL-6R基因與原核表達載體PET15b連接，轉(zhuǎn)入宿主細胞，建立 表達載體；

(2)、將構建好的重組質(zhì)粒pET15b-sIL-6R轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21 中進行誘導表達和SDS-PAGE電泳，選取表達量最高的菌作為原始菌 種保存?zhèn)溆茫?

(3)、將原始菌種進行培養(yǎng)和誘導，提取包涵體。