[發明專利]在體外用ELISA方法建立的IL－6/sIL－6R結合的分子模型

無效

• 申請號: 200710053142.4
• 申請日: 2007-09-06
• 公開（公告）號: CN101246160A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 劉朝奇;王艷林;鄒坤;柳長柏;韓鈺;楊凡;柳發勇;高明星;史繼靜;楊祖偉
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/15
• 代理公司: 武漢開元專利代理有限責任公司
• 代理人: 馬輝

技術領域

本發明涉及一種人白細胞介素-6(interluekin-6，IL-6)在原核細胞中的表達和采用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R(solubleinterluekin-6?receptor，sIL-6R)特異結合的體外分子模型，及該分子模型在藥物篩選中的應用方法。?

背景技術

白細胞介素-6(interluekin-6，IL-6)是一種由淋巴類及非淋巴類細胞分泌產生的具有復雜生物學功能的細胞因子，如成纖維細胞、單核細胞、某些T細胞系等都可以產生。IL-6在機體的免疫應答調節、急性期應答反應和造血過程中均起著重要作用，是迄今發現的功能最為廣泛的細胞因子之一。它可以促進多種細胞的增殖和分化，刺激T細胞增殖、促進T細胞產生IL-2及表達IL-2受體；誘導細胞毒T細胞和巨噬細胞的分化，特別是在誘導B細胞分化成能分泌抗體的漿細胞方面起重要的作用。?

成熟的IL-6含有184個氨基酸殘基，分子量為26KD的糖蛋白。人IL-6前體為212肽，包括一段28肽的信號肽，轉錄后修飾時有N糖基化、0糖基化和磷酸化。其中N端23個氨基酸殘基對整個IL-6分子組成起穩定作用。IL-6分子中有4個半胱氨酸，形成兩對二硫鍵(Cy544-Cys50和Cys83)，其活性要求Cys正確配對。IL-6由4個反平行排列的α螺旋和C端(171-181位氨基酸)受體結合點組成，其中第179個精氨酸殘基對于和受體的結合非常重要。?

IL-6通過與靶細胞表面的特異性受體結合而發揮其生物學作用。IL-6R系統由兩條多肽鏈組成：α鏈即配體結合鏈，β鏈即信號傳導鏈(gp130)，IL-6首先與α鏈低親和力連接，然后復合物募集gp130形成具有信號傳導功能的高親和力復合物IL-6/IL-6Rα/gp130，gp130的胞漿區是信號傳遞的關鍵。只有破骨細胞及肝細胞等的細胞膜上存在α鏈受體，健康人血清中存在可溶性的IL-6Rα。gp130分布極其廣泛，這是其具有廣泛生物學功能的物質基礎。?

IL-6有多個方面的生物學活性，包括調節免疫應答、調節造血系統、調節神經內分泌系統及誘導炎癥反應的急性期蛋白等。?

IL-6具有調節腫瘤細胞生長的作用，促進雜交瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤、結腸癌、Kaposi肉瘤等腫瘤細胞生長和轉移。?

許多研究表明IL-6是病理狀態下調節骨吸收的重要因子，IL-6可與IL-3協同刺激粒-巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)的增殖，促使CFU-GM中早期破骨細胞前體細胞的形成。另外IL-6在自身免疫性疾病如類風濕性關節炎、結腸炎、系統性紅斑狼瘡的發生和發展中具有重要作用。?

基因工程技術自20世紀70年代初產生后發展迅速，Tonouchi報道了在大腸桿菌中表達IL-6的基因工程方法。到目前為止，外源真核基因在原核細胞中的表達是人類了解最深入，實際應用最廣泛的表達系統。80年代以前，以大腸桿菌為宿主，表達真核cDNA、細胞毒素及病毒抗原基因等，為人類獲取大量有價值的多肽及蛋白質開辟了一條新的途徑。?

由于IL-6/sIL-6R在各種病理中具有重要的作用，因此尋找有效阻斷IL-6/sIL-6R生物活性的藥物，具有廣闊的應用前景。?

發明內容

本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種在體外用ELISA方法建立的IL-6/sIL-6R結合的高通量分子模型及該分子模型在拮抗劑篩選中的應用方法。?

本發明的技術方案是這樣實現的：其特征是經過原核表達的IL-6與其受體sIL-6R在體外特異性結合，模擬體內形成具有生物學活性的IL-6/sIL-6R/gP130，然后通過ELISA方法定量測定IL-6/sIL-6R的結合。?

所述分子模型的優化條件為：包被IL-6R?1∶500；IL-6?1∶1000；IL-6抗體1∶2000。?

所述的原核表達的IL-6是通過下述方法表達得到的：?

(1)、用經過RT-PCR擴增的人IL-6?cDNA片段與原核表達載體pET28a(+)連接，轉入宿主細胞，建立表達載體，見圖1-1；?

(2)、將正確構建的重組質粒轉入感受態大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達和SDS-PAGE電泳，選取表達量最高的菌作為原始菌種保存備用；?

(3)、將原始菌種進行培養和誘導表達，提取包涵體。所述的原核表達的sIL-6R是通過下述方法表達得到的：?