[發明專利]一種快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體及其驗證載體的方法

無效

• 申請號: 200710052912.3
• 申請日: 2007-08-06
• 公開（公告）號: CN101139615A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 馬立新;孫曉艷;徐俊;曾潔瓊;李春華
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及的是基因克隆表達技術，特別是一種快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體及其驗證載體的方法。特別適合用于大規模的表達針對哺乳動物細胞的不同基因的RNA干擾單元，并對其干擾效果進行測定，用于基因功能研究。

背景資料

后基因組時代，發展能夠高通量，并有效的研究基因功能的方法和策略受到人們的迫切關注。RNA干擾技術具有特異性高，操作簡便，重復性好的優點，是基因功能研究中的重要手段之一。

目前，常用的構建表達哺乳動物細胞RNA干擾單元載體的方法主要有兩種。第一種是寡核苷酸退火法，由化學合成的部分互補，含有干擾目的基因的靶序列的兩條寡核苷酸單鏈，體外條件下退火形成雙鏈DNA，退火產物兩端突出的粘性末端，能與處理好的載體的突出末端互補，經連接轉化后，得到表達RNA干擾單元的重組質粒。常用的寡核苷酸為一反向重復序列，從這樣一個載體轉錄而來的單鏈RNA能夠回折互補配對，形成發夾結構，在細胞內經處理后形成小干擾RNA(siRNA)而引發RNA干擾效應。第二種是PCR擴增法，設計一對擴增控制RNA干擾單元表達的啟動子的PCR引物，正向引物與啟動子特異性匹配，反向引物5’末端加上額外針對目的基因的干擾序列，將PCR產物克隆到相應的載體上，得到表達RNA干擾單元的載體。這些方法在一定程度上提高了實驗效率，降低了實驗成本，但這些方法存在不足，主要表現在以下兩方面：

一、步驟繁瑣，克隆效率低。這兩種方法都需要對克隆的目的片段和載體特殊處理，需要目的片段與載體的連接反應。兩種方法中，載體都需要經過合適的酶切、純化處理。第一種方法需要化學合成的兩條寡核苷酸單鏈體外退火，得到的產物需要純化處理，然后與處理好的載體連接反應。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此難以純化，得率低，而且要鑒定正確的重組質粒較困難，假陽性率高。第二種方法需要在PCR引物中加上針對靶基因的干擾序列，通常需要長引物(通常大于70nt)或者多輪的PCR擴增反應，擴增后的PCR產物也需要與處理好的載體進行連接反應。這個過程不僅花費時間，而且增加了載體自連背景，使后續的篩選陽性克隆的過程復雜化。

二、不適合高通量的操作。兩種方法都需要預先處理純化好待克隆的目的片段，都依賴于載體與片段的連接反應。這些操作對于克隆單個或少數的目的片段可能有效，但要大規模的構建RNA干擾載體卻是非常困難的，且效率低下。此外，第一種方法需要使用的寡核苷酸單鏈通常為60-100nt，第二種方法中使用的引物通常大于70nt，合成這些長的寡核苷酸單鏈不僅實驗成本高，而且堿基合成錯誤率高。這樣就使得篩選正確RNA干擾表達質粒的步驟繁瑣，費時費力。

RNA干擾技術已經在生物學眾多領域中廣泛應用，但是，現在還沒有非常合適的方法來設計有效的干擾靶點。對于某一目的基因，一般是選擇若干個靶點，平行設計一系列的干擾RNA分子，然后分析測定其干擾的效果。常用的檢測RNA干擾水平的方法有實時定量PCR、Northern?Blot、Western?Blot檢測等，為了克服這些方法費時費力且難以大規模使用的不足，有人發展出一種新的方法，即將全長的或部分靶基因與報告基因融合表達，通過檢測報告基因的表達量變化而評價目的基因被干擾的程度。但是，這一方法的缺點在于需要有全長或部分的cDNA序列。Quan?Du等提出了一種利用含有RNA干擾靶序列的短寡核苷酸與報告基因融合來有效篩選RNA干擾單元的方法，此方法不依賴于cDNA的實物序列，適于高通量的驗證RNA干擾效果。目前，構建這種新型RNA干擾驗證載體采用的都是寡核苷酸退火法，其主要缺點有以下兩點：

一、步驟繁瑣，克隆效率低，不適合高通量的操作?；瘜W合成的兩條寡核苷酸單鏈通常小于50nt，體外退火，得到的產物需要純化處理，然后與處理好的載體連接反應。因此，存在難以純化，得率低，要鑒定正確的重組質粒較困難，假陽性率高，不適合高通量的操作的缺點。

二、難以構建同時含有多個(大于3個)需驗證靶序列的載體。由于針對同一個基因常常設計多個干擾RNA，為了簡化實驗步驟，可將多個需驗證的靶序列構建在同一個驗證載體上。利用寡核苷酸退火法，若對于4個以上的RNA干擾靶位點進行驗證，所需要的寡核苷酸就會大于80nt，對于更多的靶位點，所需要的寡核苷酸長度就會相應增加。這樣，實驗成本高，而且寡核苷酸合成的堿基錯誤率會升高。