[發明專利]一種快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體及其驗證載體的方法

無效

• 申請號: 200710052912.3
• 申請日: 2007-08-06
• 公開（公告）號: CN101139615A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 馬立新;孫曉艷;徐俊;曾潔瓊;李春華
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所
• 代理人: 丁齊旭

1.一種快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體的方法，特征在于：

1)對RNA干擾載體進行改造，在載體的控制RNA干擾單元表達的啟動子與終止信號之間克隆一ccdB基因表達單元，得到表達表達發夾RNA(shorthairpin，shRNA)的RNA干擾骨架載體；

2)引物設計，設計針對目的基因進行RNA干擾的靶序列，根據1)所述的RNA干擾骨架載體的控制RNA干擾單元表達的啟動子和終止信號序列，設計一對部分重疊，且帶有針對目的基因靶序列的寡核苷酸引物；

3)反向PCR擴增、轉化及篩選重組質粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干擾骨架載體為模板，進行PCR擴增；PCR產物轉化大腸桿菌感受態細胞，PCR產物經同源重組自環化，得到表達目的基因特異性的RNA干擾載體。

2.根據權利要求1所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體的方法，其特征在于對于表達類microRNA的RNA干擾載體的構建為：

1)對RNA干擾載體進行改造，是在載體控制RNA干擾單元表達的啟動子與終止信號之間的microRNA?5’與3’側翼序列之間克隆一ccdB基因表達單元，得到表達類microRNA的RNA干擾骨架載體；

2)引物設計，根據5’側翼序列和3’側翼序列設計一對部分重疊，且帶有針對目的基因靶序列的寡核苷酸引物，同時在兩條引物5’末端依次加上干擾目的基因的靶序列和microRNA特異性的環序列，并使得兩條引物末端帶有10-15nt的重疊區；

3)反向PCR擴增、轉化及篩選重組質粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干擾骨架載體為模板，進行PCR擴增；擴增的產物，缺失了模板的ccdB基因表達單元，在microRNA的兩側翼序列之間引入了靶和環序列，通過轉化大腸桿菌感受態細胞，PCR產物通過同源區重組自環化，得到的重組質粒能夠表達類microRNA的RNA干擾單元。

3.根據權利要求1或2所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體的方法，其特征在于能夠構建表達類microRNA、表達小干擾RNA(smallinterference?RNA，siRNA)、表達發夾RNA(shRNA)的干擾載體；或者用于構建由不同啟動子控制表達RNA干擾單元的載體，可以是RNA聚合酶III型啟動子或者RNA聚合酶II型啟動子控制的，組成型或者是誘導型啟動子控制的干擾載體，細胞或組織特異性啟動子控制的。

4.根據權利要求1或2所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體的方法，其特征是用于構建在哺乳動物細胞中表達RNA干擾單元的多種載體，包括質粒表達載體和病毒載體。

5.一種快速高效構建哺乳動物細胞RNA驗證載體的方法，特征在于：

1)載體改造，對于已有的表達報告基因的載體，在報告基因與加尾信號(或啟動子)之間引入ccdB基因表達單元，得到進行RNA干擾驗證的骨架載體；

2)引物設計，根據1)所述的報告基因和終止信號(或啟動子)序列，設計一對部分重疊，且含有需驗證的靶序列的寡核苷酸引物，同時引物5’末端加上需驗證的干擾目的基因的靶序列，并使得引物末端帶有相互重疊10-15nt的序列；

3)反向PCR擴增、轉化及篩選重組質粒，利用2)所述的引物，以1)所述的RNA干擾驗證的骨架載體為模板，進行PGR擴增；擴增的產物，缺失了ccdB基因表達單元，PGR產物轉化大腸桿菌感受態細胞，經同源重組自環化，篩選得到靶序列和報告基因融合的RNA干擾驗證質粒。

6.根據權利要求5所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾驗證載體的方法，其特征在于，該載體可驗證的靶序列包括來源于載體表達的和化學合成的siRNA；對于每一個RNA干擾靶位點，與之融合的報告基因是熒光素酶基因，或者是β-半乳糖苷酶基因，或者是氯霉素酰基轉移酶CAT基因，或者是堿性磷酸酯酶基因，或者是綠色熒光蛋白基因，或者其它報告基因。

7.根據權利要求5或6所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾驗證載體的方法，其特征在于以一個含有報告基因的載體為骨架，可構建出同時含有多個待檢測的RNA干擾靶序列的驗證載體。

8.根據權利要求1或5所述的快速高效構建哺乳動物細胞RNA干擾載體及其驗證載體的方法，其特征在于PCR過程中所使用引物的重疊區長度可以根據實際需要，在5nt～30nt之間調整。