[發明專利]一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測試劑盒及應用

無效

• 申請號: 200710052821.X
• 申請日: 2007-07-24
• 公開（公告）號: CN101101297A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 胡薛英;彭婉芬;程國富;谷長勤;張萬坡
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/543
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于禽類免疫學技術領域，具體地，本發明涉及一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集試劑盒的研制及其在1型鴨肝炎病毒抗體檢測中的應用。

背景技術

鴨病毒性肝炎(Duck?virus?Hepatitis，簡稱DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck?Hepatitis?virus，簡稱DHV)引起的雛鴨高度致死、高度傳播性的病毒性傳染病。臨床上以具有明顯神經癥狀和肝臟腫大、表面呈斑點樣出血為特征。其主要侵害6周齡以內雛鴨，尤以2日至3周的雛鴨最為易感，成年鴨有抵抗力。不同日齡的雛鴨發病后，死亡率有所不同，有的高達95％，有的低于15％。耐過的鴨成為僵鴨，生長和發育受到障礙嚴重影響經濟效益。1945年Levinl最先在美國發現DVH，其后，在英國、加拿大、德國、意大利、印度、法國陸續地報道了本病流行情況。我國黃均建等首次報道了上海某鴨場于1958年秋至1962年春本病的暴發和流行情況，次后，全國各地都相繼報道了本病的爆發與流行。鴨肝炎病毒有1型、2型和3型3個血清型，1型DHV呈世界分布，2型DHV局限于英格蘭，3型主要局限于美國。近年來，隨著我國養鴨業的規模化發展，雖對種鴨、雛鴨進行了免疫預防，但DVH仍然時有發生，并常與病毒、細菌混合感染，給臨床診斷與防制帶來了很大的困難。在疾病爆發時，雛鴨的死亡速度驚人。對本病最有效的防制方法是用DHV-1疫苗免疫種鴨，使后代雛鴨獲得高水平的母源抗體從而達到被動免疫的目的。另外，雛鴨在1日齡免疫弱毒疫苗，3～7d可產生免疫力，但母源抗體可影響免疫效果，所以在免疫前應對雛鴨母源抗體水平進行檢測，否則可能導致免疫失敗。建立1型鴨肝炎抗體的血清學檢測方法，了解鴨病毒性肝炎抗體的消長和轉移情況有利于制定有效的免疫程序。

目前，檢測1型鴨肝炎病毒抗體方法主要有中和試驗(SN)、瓊脂擴散試驗(AGP)、免疫熒光試驗(?IF)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。中和試驗是檢測1型鴨肝炎病毒抗體最根本、最經典的方法也是國家標準方法，但該方法比較煩瑣，需要很有經驗的人員來操作，而且存在著固有的一些不足之處，比如操作繁瑣、需時長，存在生物安全性等問題，不適合基層推廣。瓊脂擴散和免疫熒光試驗在敏感性和特異性方面都不盡人意，且田間樣本復雜多變，干擾大，使得這些方法在臨床檢測中的應用受到一定限制。ELISA雖然相對容易一些，但仍然需要一定的儀器設備和操作技能需要時間也較長(3-5小時)。乳膠凝集試驗(Latex?Aagglutination?Test，簡稱LAT)由于其迅速(3分鐘)、簡單和無須專門的技能和任何特殊儀器設備而具有巨大的優勢。

提純病毒的方法很多(殷震等編著：《動物病毒學》，科學出版社)，但不同的病毒，由于結構及理化特征不同，其最適提純方法不同。在鴨肝炎病毒的提純方面，眾多的學者通過不同的方法進行提純，但是眾說紛紜，一直以來沒有一種公認的可重復性強的方法。目前由于病原病毒提純困難，難以獲得高濃度高純度的病毒，使得應用于臨床的診斷一直存在發展瓶頸。蔣文燦等，用六種方法提純1型DHVSC株，電鏡觀察比較了提純結果。以“氯仿去脂一硫酸銨沉淀一蔗糖密度梯度離心法”最佳。(蔣文燦，廖德惠，謝鏡懷.雛鴨病毒性肝炎的研究[J].中國獸醫雜志，1989，15(1)：9-11.)然而，1990年羅函祿等亦采用此種方法純化病毒并用電鏡觀察確定病毒純化程度，所得結果與蔣文燦等不一致，病毒粒子大小極不均一，可能是硫酸銨沉淀破壞了病毒的形態結構。且病毒在蔗糖中的浮密度為30％，可能是離心力不同所致。而且蔗糖較難達到完全脫糖從而易滋生細菌，影響滅活病毒液在較高溫度下的保存期。而羅函祿等所采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纖維素色譜法取得了較好的提純效果(羅函祿，徐汗祥，范文明等.鴨病毒性肝炎的研究[J].中國畜禽傳染病，1990，(3)：1-3.)。但是，采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纖維素色譜法均操作較繁瑣，且穩定性差，病毒損耗大等缺點不適合生產化大量純化病毒。趙新柳(ELISA檢測鴨病毒性肝炎抗體的研究[J]，中國獸醫科技，1990，(11)：5-6)??曾提出差速超高速離心效果較好。因而，本申請人在此基礎上作出進一步的改進，提高最超離速度增加病毒收集量，同時摸索出合適的離心速度組合，提高病毒的純度。此法具有操作簡單，穩定性好，病毒純度高的特點。