[發明專利]人白細胞介素24增強抗結核的作用

有效

• 申請號: 200710052156.4
• 申請日: 2007-05-11
• 公開（公告）號: CN101070542A
• 公開（公告）日: 2007-11-14
• 發明（設計）人: 章曉聯;孫平
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C07K14/54;A61K38/20;A61P31/06
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司
• 代理人: 王守仁

技術領域

本發明屬于分子微生物學以及分子和感染免疫領域，特別是涉及一種人白細胞介素24(Interleukin-24，IL-24)增強抗結核的作用。

背景技術

結核病(Tuberculosis，TB)是一種嚴重危害人類健康的傳染病，由結核桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，MTB)感染引起。目前全球結核病疫情仍十分嚴峻，據世界衛生組織估計，2005年有880萬新結核病例，740萬例在亞洲和撒哈拉以南非洲。共有160萬人死于結核，包括感染艾滋病毒的195000名患者。在全球22個結核高負擔國家中，我國位居第二，僅次于印度^[1]。接種卡介苗(BCG)是目前預防結核病的主要措施，但大規模的疫苗控制試驗表明其保護效力不夠理想。BCG免疫效果不穩定，對成人沒有保護作用，可干擾皮膚結核菌素試驗結果，并且不能用于免疫功能缺損患者^[2]。因此，需要發展更有效的疫苗來控制結核病。

近20年國際組織提出控制結核病主要方法有：①發現和治療痰菌陽性者；②新生兒接種卡介苗(BCG)，約80％獲得保護力。BCG作為疫苗具有抗結核病的功效首先在印度提出，毫無疑問BCG能保護嬰兒，但這種保護作用的持久性很有限，好象不能持續到成年；而且，卡介苗是活疫苗，苗內活菌數直接影響免疫效果。盡管早期用BCG接種在兒童中具有非常好的效果，然而靠接種來提供終生保護的概念并非出自BCG，這和BCG不能在人體中持續存在超過三年的事實有關^[3]。因此，BCG最終就喪失了其使效應T細胞及非特異性巨噬細胞活化的能力。它和野生型TB相反，后者能在宿主體內持續存在直至宿主死亡。在許多例子中也顯示，持續低水平結核感染能使包括老年在內的免疫抑制期的感染加劇。

目前結核病疫苗的研究一方面集中于改善BCG的免疫原性，另一方面則集中于開發新型疫苗以代替傳統BCG。但DNA疫苗在單獨注射時難以發揮保護作用，因此如何提高其免疫保護能力迫在眉睫^[4]。

白細胞介素24(Interleukin-24，IL-24)，最先于1995年從人的黑色素瘤HO-1細胞中分離得到克隆，該基因在誘導分化的黑色素瘤細胞中高表達，并能促進黑色素瘤細胞分化，因此最初命名為MDA-7(黑色素瘤分化相關基因-7melanoma?differentiation-associatedgene-7)^[5]。IL-24可誘導人外周血單個核細胞產生高水平IFN-γ、IL-6、TNF-α，以及少量IL-1β、IL-12和粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，提示IL-24是一種免疫調節分子，主要表現為對TH1型細胞因子的誘導，具有抗腫瘤作用和抗感染作用^[6]。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種增強抗結核DNA疫苗Ag85B保護效果的細胞因子，利用構建用于增強人機體免疫應答的細胞因子pVAX1-IL-24質粒，通過肌肉注射方式與抗結核DNA疫苗Ag85B共同免疫，使被免疫者能夠抵抗結核桿菌的感染。從而為其開辟了在抗結核感染中制備新型有效的抗結核DNA疫苗的新途徑。

本發明解決其技術問題采用以下的技術方案：

本發明提供的人白細胞介素24具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，該序列含有人白細胞介素24蛋白分子的601個堿基。

人白細胞介素24的重組質粒pVAX-1-IL-24，其構建包括用PCR法將人白細胞介素24cDNA從pcDNA3.1-IL-24擴增與純化，得純化的PCR產物，構建到真核表達載體pVAX-1上，該構建包括以下步驟：

(1)重組質粒pVAX-1-IL-24的構建和獲得：

將純化的PCR產物和載體pVAX-1用BamHI和XhoI雙酶切后，分別回收酶切產物，用T4DNA連接酶定向將人白細胞介素24基因片段與pVAX-1連接，以連接產物轉化入DH5α感受態細菌，在LB?kan+培養基中篩選培養；挑取陽性克隆，培養后小量提取質粒，用BamHI和XhoI雙酶切，在1％瓊脂糖凝膠檢測，獲得正確的重組質粒pVAX-1-IL-24，

其中，PCR所用的上游引物p1、下游引物p2的序列分別為SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列，即：

上游引物p1：5′-GGGATCATGAATTTTCAACAGAGGCTG-3′，酶切位點為BamHI，