[發明專利]一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法

無效

• 申請號: 200710051668.9
• 申請日: 2007-03-15
• 公開（公告）號: CN101054602A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 汪光熙;李偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢植物園
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

????????????????????????????技術領域

本發明涉及檢測多倍體植物在自然條件下所產生的基因內單核苷酸點突變之領域，更具體涉及一種檢測具多基因系統(multigene?system)的多倍體植物基因核苷酸點突變的方法。在開發DNA標記時，對于能否迅速檢測出DNA變異是很重要的。但以往采用的多為DNA測序法，這不僅需要大量勞力，而且成本也很高。本發明可迅速檢測大量的SNP(Single?Nucleotide?Polymorphism)，還可以應用于具多基因系統的多倍體品種的識別。

????????????????????????????背景技術

目前國內外有一些檢測植物基因單核苷酸點突變的方法，例如：PCR-單鏈構象多態性分析法(PCR-SSCP)、PCR-變性梯度凝膠電泳法(PCR-DGGE)、PCR-擴增特異的等位基因分析法(PCR-PASA)等。

PCR-SSCP分析技術根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。當DNA單鏈自發形成二級結構時，其構象又取決于DNA分子的一級結構。通過放射性核素標記自顯影或者銀染，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳中不同構象影響DNA片段的遷移率，來區分正常基因與突變基因。PCR-SSCP技術的缺點：檢測存在假陽性，分析片段的大小受限，強烈依賴實驗條件之選擇，可能會漏檢突變。而本發明所是用雙色紅外螢光檢測技術來檢測CEL?1酶切產物，能夠有效排除假陽性條帶。PCR-DGGE：DNA分子的穩定性主要依靠配對堿基間的氫鍵維系，A-T間有2個氫鍵，G-C間有3個氫鍵。當溫度升高到一定程度時，氫鍵斷裂，兩條單鏈分開，習慣上稱這一溫度范圍的中點為解鏈溫度(Tm)。不同的DNA分子由于堿基組成不同而有各自不同的Tm，當一段DNA序列中發生點突變時其Tm也將隨之發生變化。PCR-DGGE技術正是利用了這一原理，在設計引物時使擴增的目的片段兩端具有不同的Tm值，一端較高，另一端相對較低。同時PCR產物分離所用的聚丙烯酰胺凝膠上事先加入變性劑，并形成由低到高的濃度梯度。當PCR產物進行電泳時，不同的DNA片段在特定的濃度位置發生變性，由雙鏈解離成單鏈，導致片段的遷移率大幅度下降。這樣不同的片段變性時間不同，它們在凝膠中位置也就不同，據此就可以區別正常片段與異常片段。PCR-PASA的原理是根據DNA聚合酶，只有在寡聚核苷酸引物3′末端堿基與模板相應堿基完全相配時，才能催化形成磷酸二酯鍵，使引物延伸。如果引物末端3′堿基位對應的模板位堿基發生點突變，則PCR反應將無法進行。這樣，通過設計不同長度的引物，以改變引物3′端堿基的位置，根據PCR反應發生情況，得知對應模板位堿基是否發生了點突變。

以上方法均存在有成本較高，費時，效率不及EcoTILLING法和本發明的SuperEcoTILLING法。

EcoTILLING法和本發明的SuperEcoTILLING法都具有成本低，效率高的特點，但如圖1和圖2所示，一般的EcoTILLING法需從野生型(wild?type)植物和變異型(mutant?type)植物中分別提取總DNA，然后將兩種DNA按1∶1進行混合；而本發明的SuperEcoTILLING法不需將來自不同植株的總DNA進行混合。

????????????????????????????發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法。該方法簡便，它主要用于具有多基因系統的多倍體植物，其優點是只需設計對多基因系統內的某兩個目標基因具有特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增。其效果很好，方法易行，實驗操作方便，具有百分之百的可重復性。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案是：

TILLING(Targeting?Induced?Local?Lesions?IN?Genomes，定向誘導基因組局部突變)法是一種全新的反向遺傳學(reverse?genetics)方法。它將誘發產生高頻率點突變的化學誘變方法與PCR篩選技術和Li-Cor公司生產的4300DNA遺傳分析系統的雙色紅外螢光高通量檢測技術有效結合，快速有效地從化學誘變劑(EMS)誘變產生的突變群體中鑒定出點突變，這一全新的，高通量，低成本的反向遺傳學研究方法大大地方便了植物基因組學的研究。另外，以自然條件下產生的遺傳變異個體為研究材料的則稱為EcoTILLING。