[發(fā)明專利]一種檢測(cè)多倍體植物基因單核苷酸點(diǎn)突變的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710051668.9
• 申請(qǐng)日: 2007-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN101054602A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪光熙;李偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢植物園
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 王敏鋒

1、一種檢測(cè)多倍體植物基因單核苷酸點(diǎn)突變的方法，包括下列步驟：

A、所用材料為多基因系統(tǒng)的水田雜草鴨舌草，用DNA提取試劑盒從鴨舌草中提取總DNA；

B、設(shè)計(jì)對(duì)基因系統(tǒng)/ALS1、ALS2、ALS3和ALS4內(nèi)的兩個(gè)目標(biāo)基因/LS1和ALS3具特異性的一對(duì)引物，其序列分別為：TCTGCATCGCCACCTCG和TGAAGCAGATGGAGG?GCAGG，行First?PCR擴(kuò)增/兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記，其標(biāo)記序列分別為gctacggactgacctcggac和ctgacgtgatgctcctgacg，順向引物序列為：gctacggactgacctcggacTCTGCATCGCCACCTCG，反向引物序列為：ctgacgtgatgctcctgacgTGAAGCAGATGGAGGGCAGG；

C、所設(shè)計(jì)的引物僅對(duì)兩個(gè)目標(biāo)基因/ALS1和ALS3具特異性，擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物中既有ALS1基因也有ALS3基因；

D、First?PCR反應(yīng)完成后，往PCR管內(nèi)加90μl滅菌蒸溜水與PCR產(chǎn)物混合，然后將PCR管內(nèi)的混合物全部轉(zhuǎn)入到密理博96孔濾膜板內(nèi)，在室溫條件下抽真空干燥，抽干后再加120μl滅菌蒸溜水到密理博96孔濾膜板的各孔內(nèi)，再次抽真空干燥，最后再加30μl滅菌蒸溜水到各個(gè)孔內(nèi)，置搖蕩器上搖蕩；

E、將以上純化了的PCR產(chǎn)物稀釋1/20倍/5μl純化后的PCR產(chǎn)物+95μl滅菌蒸溜水，用做Second?PCR的Template?DNA；

F、接著進(jìn)行Second?PCR，螢光引物被使用，在操作過程中避免光照；

G、接著將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由兩個(gè)目標(biāo)基因/ALS1基因和ALS3基因序列所形成的異源雙鏈核酸分子；再用特異識(shí)別并切割錯(cuò)配堿基的核酸內(nèi)切酶剪切異源雙鏈核酸分子；

H、變性處理后采用DNA遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行雙色聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖；其后分別設(shè)計(jì)兩個(gè)目標(biāo)基因中的一個(gè)基因/ALS1或ALS3具特異性的引物，再次進(jìn)行篩選，檢測(cè)出發(fā)生變異的基因，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以確認(rèn)變異是發(fā)生在ALS1基因上還是發(fā)生在ALS3基因上。