[發明專利]中華鱘精子超低溫冷凍保存技術及工藝

無效

• 申請號: 200710051592.X
• 申請日: 2007-02-15
• 公開（公告）號: CN101084927A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 柳凌;危起偉;張潔明;郭峰;朱永久
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;A01N1/00;F25D3/10
• 代理公司: 荊州市技經專利事務所
• 代理人: 王春玲

技術領域

本發明涉及到魚類精子超低溫冷凍保存方法，特別是對中華鱘精子超低溫保存方法。

背景技術：

隨著魚類苗種人工繁育和遺傳育種研究的發展，魚類精子超低溫冷凍保存技術已引起人們的關注，魚類精子超低溫冷凍保存首次成功是在1968年，用保存30天(-196℃)白鱔魚精，獲得了80-89％的受精率。近年來，魚類精子超低溫冷凍保存已逐步擴展到鯉科、鱸科、鯰科、鱺科以及鮭魚鱒魚類。

中華鱘是珍稀魚種之一，屬我國一級保護動物，它是我國特有的大型淡水魚類，主要分布于長江水系和珠江水系。近來年，由于水質污染的加劇，以及捕撈強度增大，中華鱘種群銳減，提高中華鱘人工繁殖及人工放流技術，以幫助該種群恢復，已受到黨和政府高度的重視，也是水產界重大的科研課題。

目前，中華鱘親魚的來源完全是葛洲壩下的自然群體，但是在進行人繁殖的過程中，由于是天然捕撈的親魚，個體較大，獲得親魚的數量受到很大的限制，從而極易導致雌、雄親魚性腺成熟不同步。實際繁殖過程中，往往是雄魚成熟了，雌魚尚未排卵；或有了成熟的雌魚，卻沒有雄魚。兩者之間時間相差短的為幾小時，或者1～2天；長的時間甚至可達上十天。

另一方面，由于中華鱘為大型魚類，授精一條雌魚一般需幾百，甚至上千毫升精液，使本來數量有限的親本有效利用率進一步下降，成本增多。而且，中華鱘精子一旦被擠出體外后，允許進行超低溫保存的操作時間為12小時，目前魚類的冷凍保存技術每小時最多只能完成5～8毫升左右的精子保存，而1條中華鱘精液約為1000毫升。以目前的技術，最多只能有100毫升可用于低溫保存，不能適應大型魚類即中華鱘保存精子的需要。

發明內容：

本發明的目的是：實現對中華鱘精子超低溫冷凍批量保存，解凍后的受精率達到70％以上。

本發明的另一目的是：實現我國特有的大型、珍稀、瀕危魚類中華鱘精子的長期超低溫冷凍保存。

本發明的技術方案如下：

本發明的工藝為：鮮精采集及活力檢測、精子稀釋、抗凍劑及分裝、程序降溫、進入液氮。

1、鮮精的采集：擠壓成熟雄中華鱘的腹部，即可收集到鮮精，在收集鮮精過程中，應絕對避免精子與水接觸，收集到的鮮精放入密封的塑料袋中，在溫度為4℃的冰箱或容器中保存；

2、鮮精鏡檢：在10×10倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到85％，平均曲線運動速度達到160微米/秒以上，平均直線運動速度達到90微米/秒以上，即可冷凍；

3、中華鱘稀釋液配制：魚類精子被激活是依靠精子自身的滲透壓與周圍環境水中滲透壓差來實現的，溫水魚類精子是由淡水環境的低滲所誘發，而海水魚類精子運動則由海水的交滲所刺激。而滲稀釋液的作用是：實現精子的長期保存，確保精子在保存過程中處于完全靜止狀態；

中華鱘稀釋液的配制：20～30毫摩爾Tris-HCl，30～60毫摩爾蔗糖，2～10毫摩爾KCl，蒸餾水定溶1000毫升，HCl調pH值8～8.5，然后再放入溫度為4℃的冰箱內存放；

4、精子稀釋：將中華鱘精子與稀釋液按1∶3比例在燒杯中混合并搖勻，然后放置于溫度為4℃的冰箱內平衡20分鐘；

5、程序降溫度儀開機：連接好程序降溫儀所有線路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，關好泵上氣閥，打開電腦和程序、機后開關、液氮泵開關、使液氮壓力升至0.2ibf/in²以上；打開降溫儀開關，降溫程序啟動，使降溫倉溫度在15～20分鐘內降至0℃，等待加樣；

6、加抗凍劑及分裝：將上述稀釋平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇終濃度達到9～10％，混勻后立即分裝，用2毫升微量進樣器進行分裝，分裝入2毫升冷凍管中，一次可裝10支管，約需時間為10秒鐘，于3～4分鐘完成分裝，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中，

所述的抗凍劑，是利用其脫水作用，使精子中的部分水脫出，因為精子內含有大量的水分，當精子在降溫冷凍過程中，在通過冰晶形成區(一般為-15℃～-60℃)時，其內部會形成冰晶，從而破壞細胞膜，導致精子死亡，加入脫水劑之后，可使精子中的水部分脫出，以達到降低精子冰點的目的，防止精子在冷凍過程中嚴重脫水和低溫休克；