[發明專利]中華鱘精子超低溫冷凍保存技術及工藝

無效

• 申請號: 200710051592.X
• 申請日: 2007-02-15
• 公開（公告）號: CN101084927A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 柳凌;危起偉;張潔明;郭峰;朱永久
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;A01N1/00;F25D3/10
• 代理公司: 荊州市技經專利事務所
• 代理人: 王春玲

1、中華鱘精子超低溫冷凍保存的方法，其特征是：

(1)、鮮精的采集：擠壓成熟雄中華鱘的腹部，即可收集到鮮精，在收集鮮精過程中，應絕對避免精子與水接觸，收集到的鮮精放入密封的塑料袋中，在溫度為4℃的冰箱或容器中保存；

(2)、鮮精鏡檢：在10×10倍的顯微鏡下進行鏡檢，計算機輔助檢測鮮精平均活率達到85％，平均曲線運動速度達到160微米/秒以上，平均直線運動速度達到90微米/秒以上，即可冷凍；

(3)、中華鱘稀釋液配制：20～30毫摩爾Tris-HCl，30～60毫摩爾蔗糖，2～10毫摩爾KCl，蒸餾水定溶1000毫升，HCl調pH值8～8.5，然后再放入溫度為4℃的冰箱內存放；

(4)、精子稀釋：將中華鱘精子與稀釋液按1∶3比例在燒杯中混合并搖勻，然后放置于溫度為4℃的冰箱內平衡20分鐘；

(5)、程序降溫度儀開機：連接好程序降溫儀所有線路，液氮罐中加液氮30升以上，放好液氮泵，關好泵上氣閥，打開電腦和程序、機后開關、液氮泵開關、使液氮壓力升至0.2以上；打開降溫儀開關，降溫程序啟動，使降溫倉溫度在15～20分鐘內降至0℃，等待加樣；

(6)、加抗凍劑及分裝：將上述稀釋平衡后的精子加入甲醇，使其甲醇終濃度達到9～10％，混勻后立即分裝，用2毫升微量進樣器進行分裝，分裝入2毫升冷凍管中，一次可裝10支管，需時間為10秒鐘，于3～4分鐘完成分裝，將分裝好的冷凍管放入冷凍架上，立即放入程序降溫儀的冷凍倉中；

(7)、程序降溫：降溫程序為0℃開始，以3℃/分鐘的速度從0℃降至-5℃，以5℃/分鐘的速度從-5℃降至-15℃，以10℃/分鐘速度從-15℃降至-25℃，再以20℃/分鐘速度從-25℃降至-80℃，最后平衡5分鐘，降溫完成后，直接將精子從程序降溫儀中取出，立即放入液氮罐中，在-196℃溫度中保存，從0℃開始降溫起一直到精子轉入液氮罐中止，其操作時間需20分鐘完成；

(8)、每批精子按第4～6步驟可冷凍100毫升鮮精，當第1批精子進行到第7步時，第2批精子可從第4步開始操作。