[發明專利]檢測痕量辣根過氧化物酶的分光光度法

無效

• 申請號: 200710049975.3
• 申請日: 2007-09-04
• 公開（公告）號: CN101201316A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 蔣治良;馬紀
• 申請（專利權）人: 廣西師范大學
• 主分類號: G01N21/25
• 分類號: G01N21/25;G01N21/31;C12Q1/28
• 代理公司: 桂林市華杰專利事務所有限責任公司
• 代理人: 羅玉榮

技術領域：

本發明涉及檢測痕量辣根過氧化物酶的方法，特別是一種用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的方法。

背景技術：

辣根過氧化物酶(Horseradish?Peroxidase，簡稱HRP)是一種非常重要的過氧化物酶，在分析化學、環境科學、臨床化學、有機合成等領域均有重要的應用。測定游離HRP和各種HRP標記中HRP的含量可以間接地測定體液和其他組織液中抗體或抗原的量，對于免疫學及組織化學的研究以及臨床疾病的診斷具有十分重要的意義。

基于HRP催化H₂O₂氧化無色的苯胺類、苯酚類衍生物，生成具有顏色、熒光或電化學活性的醌式或偶氮類二聚或多聚產物，可用分光光度法、熒光法或電化學方法檢測HPR活性和H₂O₂，并廣泛用于酶聯免疫和酶分析。

現有的測定HRP活性的方法主要有分光光度法，熒光光度法、化學發光法，以及酶聯免疫吸附分析法、酶聯熒光免疫分析法、電化學酶聯免疫分析法等。其中伏安酶聯免疫分析法靈敏度較高，但操作比較繁瑣。上述方法主要存在兩個缺點：第一，所用底物多為苯胺類、苯酚類衍生物，穩定性較差，見光或空氣極易被氧化，更為不足的是苯胺類底物具有致癌作用，使它的應用受到限制。第二，HRP是一種對氫供體底物(如酚、胺、抗壞血酸等)缺乏特異性氧化的酶，可以催化氧化多種底物，因而底物類似物對測定也有干擾。因此，研究HRP的新底物和新方法具有重要意義。

發明內容：

本發明的目的是為克服現有技術的不足而提供一種用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的方法。

本發明目的采用如下技術方案來實現：

本發明研究了陽離子表面活性劑溴代十四烷基吡啶(TPB)-HRP-KI-H₂O₂體系的光度法特征及其分析應用。在酸性條件下，HRP可以催化H₂O₂與過量的I^-反應生成I₃^-，I₃^-與陽離子表面活性劑TPB等形成締合物微粒(TPB-I₃)_n，該締合物微粒存在吸收效應，HRP濃度在一定范圍內與TPB體系304nm處的吸光度呈線性關系。據此建立一種靈敏度高、選擇性好、簡便快速測定痕量HRP的光度法。

本發明采用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶。具體檢測方法包括如下步驟：

1.在5.0mL的具塞試管中，依次加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI和HRP；

2.在步驟1的具塞試管中再加入H₂O₂，搖勻；

3.將步驟2的試管置于溫水浴中，再加入TPB，搖勻，用蒸餾水定容至2.5mL

4.將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上掃描得到體系的吸收光譜，以不加HRP測得的吸收強度為空白；

5.將上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計測定304nm處的吸光度，繪制標準工作曲線，根據標準曲線：A_abs＝0.0801c+0.1252，R²＝0.9981，即可求得辣根過氧化物酶在0.4～3.2ng/mL范圍內的濃度。

步驟1所述的具塞試管中，依次加入的HAc-NaAc緩沖溶液，其pH值為4.6～5.2，體積0.2～0.5mL，加入的KI濃度為4×10^-3mol/L～6×10^-3mol/L，加入的HRP濃度為0.1μg/mL，體積為10～80μL；

步驟2所述的加入的H₂O₂濃度為1.0×10^-5～3.0×10^-5mol/L；

步驟3所述的水浴溫度為20～30℃，水浴反應時間為25～50min，TPB濃度為2.0×10^-5～6.0×10^-5mol/L；

步驟5所述的測定波長為304nm。