[發明專利]新型耐熱植酸酶的制備方法

無效

• 申請號: 200710049502.3
• 申請日: 2007-07-12
• 公開（公告）號: CN101121928A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 曹毅;喬代蓉;白林含;徐輝
• 申請（專利權）人: 四川陽光博睿生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N1/21
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司
• 代理人: 呂建平

技術領域

本發明涉及植酸酶制備工藝技術，更具體地說，是涉及一種用于動物飼料添加劑的細菌植酸酶的制備工藝技術。

背景技術

植酸酶是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)一類酶的總稱。在禽畜飼料中添加植酸酶，其作用一是可以使飼料中的肌醇六磷酸(植酸)分解成為肌醇和磷酸，有利于動物消化吸收，使無機磷的用量降低，降低飼料成本；二是可以消除植酸的抗營養作用，提高飼料中礦物元素，如鈣、鋅、銅、鎂和鐵等生物學利用率；三是可以提高飼料中蛋白質、氨基酸、淀粉和脂質等營養物質的利用率；四是可以提高動物采食量和日增重，改善動物生產性能；五是可以顯著降低豬、禽糞便排泄物中磷的含量。在西方一些發達國家，植酸酶作為動物飼料添加劑被強制使用。

植酸酶作為動物飼料酶加劑所具有的多方面功能逐漸被人們認識，對植酸酶的研究探索不斷深入，以期開發生產出性能更好的更適合于作動物飼料添加酶的植酸酶。人們在植酸酶的研究探索過程中，已研究開發出了無花果曲霉菌(Aspergillus?fieuum)植酸酶和黑曲酶(A.niger)植酸酶。這兩種植酸酶都屬于真菌植酸酶，目前都已經商業化生產，被普遍用作動物飼料添加酶。無花果曲霉菌(Aspergillus?fieuum)植酸酶和黑曲酶(A.niger)植酸酶作為動物飼料添加酶，對于降低無機磷的用量、提高飼料中礦物元素的生物學利用率和營養物質成分利用率、提高動物采食量和日增重、降低畜禽糞便排泄物中磷含量等方面都有不同程度的改善。但也存在一些問題，其一是不能完全降解飼料中的植酸，會引起三磷酸肌醇和二磷酸肌醇的積累；二是耐熱溫度不高，80℃植酸酶基本失去活性；三是其最適環境pH值一般為5.5左右，與動物腸道環境pH值相差很大，影響酶的活性。

人們在尋找更適于作動物飼料添加劑植酸酶的研究過程中發現，細菌植酸酶相對于真菌植酸酶更適合于作動物飼料添加酶。為了獲得更適于作動物飼料添加劑的新菌植酸酶，人們對來源于大腸桿菌(E.coli)的植酸酶進行了廣泛的研究。1993年從大腸桿菌中純化出植酸酶(appA)之后，研究人員對大腸桿菌植酸酶的基本方面和產品化進行了廣泛探索。研究表明，大腸桿菌植酸酶實際上是一種雙功能酶，既表現出植酸酶活性，也表現出酸性磷酸酶活性。在大腸桿菌植酸酶產品化研究中，現有技術的水平現狀大致如下：陳寅等人將appA通過pET28載體進行表達，獲得的appA其最適溫度為60℃，最適pH為4.5。Golovan等人研究了appA編碼的雙功能酶的特點和過量生產，改造后的appA最適溫度60℃，在pH為3時顯示出最大的耐熱性。采用T7聚合酶表達系統以分批發酵方式生產植酸酶，植酸酶產量達到600U/ml。Rodriguez?E等人在巴氏畢赤酵母中進行了表達研究。美國專利US6511699采用pT7vector在大腸桿菌中過量表達appA，利用400fold(440mu/mg)增加酸性磷酸酶活性。另外還有報道將appA克隆到pBBRT，轉化到假單孢菌，研制了用于植酸酶生產的復合介質，在30℃下培養48小時，分離植酸酶并進行優化，優化的溫度和pH分別為55℃和4.0。在30-50℃貯藏2小時，酶的活性有所增加。但直到目前為止，以現有技術制備的大腸桿菌植酸酶，其保持較高酶活力的酸性pH范圍還不夠寬，與畜禽腸道的環境還不能夠完全相適應，還不能實現產業化生產。此外，工業生產植酸酶中，需要經過一個高溫制粒階段，制粒過程中的瞬間高溫會造成植酸酶的變性失活。因此，植酸酶的耐熱性也是其改造和研究的重要方向。目前開發的植酸酶產品在耐熱性能上效果不明顯，植酸酶的最適溫度在45-50℃之間，在80℃下處理10分鐘活性喪失90％以上，基本似活。

發明內容

本發明針對現有技術制備的大腸桿菌植酸酶存在的不足，旨在提供一種新的制備大腸桿菌植酸酶工藝方法，以解決現有技術制備的大腸桿菌植酸酶其保持較高酶活力的酸性pH范圍還不夠寬，與畜禽腸道的環境還不能夠完全相適應，耐熱溫度還不夠高等問題。

上述所要解決的問題可由以下公開的技術方案來解決。

本發明公開的新型耐熱植酸酶的制備方法，主要包括以下工藝步驟：

(1)基因富集：將大腸桿菌SUGL用LB培養基進行培養，提取大腸桿菌SUGL的基因；

(2)擴增反應：以大腸桿菌SUGL的基因組為模板，用Taq?DNA聚合酶進行PCR反應；