[發明專利]新型耐熱植酸酶的制備方法

無效

• 申請號: 200710049502.3
• 申請日: 2007-07-12
• 公開（公告）號: CN101121928A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 曹毅;喬代蓉;白林含;徐輝
• 申請（專利權）人: 四川陽光博睿生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N1/21
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司
• 代理人: 呂建平

1.一種新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于主要包括以下工藝步驟：

(1)基因富集：將大腸桿菌SUGL用LB培養基進行培養，提取大腸桿菌SUGL的基因；

(2)擴增反應：以大腸桿菌SUGL的基因組為模板，用Taq?DNA聚合酶進行PCR反應；

(3)酶切連接：PCR產物用限制性內切酶KpnI和XhoI雙酶切，將雙酶切目標片段插入經相同限制性內切酶雙酶切后的含有以硫氧還原蛋白為融合蛋白的表達載體，再將連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)，從轉化后的大腸桿菌中提取質粒pET32-appA；

(4)接種培養：將含有重組表達質粒pET32-appA的BL21(DE3)單菌落接種于LB培養基中培養，在其培養至對數生長期加入誘導劑IPTG誘導培養，制備得到植酸酶。

2.根據權利要求1所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于擴增反應結束后對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定回收目的片段。

3.根據權利要求1所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于誘導培養結束后，對制備的植酸酶菌體進行離心分離、超聲波破碎和電泳鑒定。

4.根據權利要求3所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于超聲波破碎的操作條件為：450W，工作9s，間歇3s，持續20min。

5.根據權利要求3所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于對離心分離得到的上清液和沉淀實施SDS-PAGE電泳鑒定。

6.根據權利要求1至5中的任一項權利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于PCR反應所選用的聚合酶為Ex?Taq?DNA。

7.根據權利要求1至5中的任一項權利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于PCR擴增反應過程的操作為：93-95℃變性處理3-65min；以94℃45s、58℃60s、72℃90s條件循環29-40次；72℃延伸處理10min。

8.根據權利要求1至5中的任一項權利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于PCR產物用限制性內切酶KpnI和XhoI雙酶切成的目的片段長為1.3kb，酶切連接所選用的表達載體為pET-32a(+)。

9.根據權利要求1至5中的任一項權利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于單菌落接種于LB培養基中培養至OD600＝0.60-0.80時加入誘導劑IPTG，誘導劑IPTG的加入量終濃度為0.1-0.5mmol/mL。

10.根據權利要求1至5中的任一項權利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于大腸桿菌SUGL和含有重組表達質粒pET32-appA的BL21(DE3)單菌落在LB培養基中進行培養的條件為：在37℃，220rpm下振蕩培養過夜。