[發明專利]一種多基因干擾的shRNA質粒表達載體及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 200710048473.9
• 申請日: 2007-02-13
• 公開（公告）號: CN101245352A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 馬義才;顧敏;馬靈
• 申請（專利權）人: 馬義才
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00
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一、技術領域

本發明涉及基因藥物領域中基于多基因干擾的shRNA質粒表達載體pSilencer-U6/H1-(shRNA)n及其構建方法與應用。

二、背景技術

RNA干擾(RNAi)是指利用雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)特異誘發與其序列同源的mRNA降解，導致相應靶基因表達被特異抑制的轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgene?silence，PTGS)現象。RNA干擾發現于1998年線蟲(C.elegans)遺傳分析。1999年人們在植物中檢測到21-25nt?RNA片段為植物RNAi所必需，被稱為小分子干擾RNA(short?or?sallinterfering?RNA，siRNA)，其作用機制在隨后的果蠅研究中被闡明，成果很快應用于抗病毒、抗腫瘤和基因功能研究。2001-2003年RNAi技術連續三年被評為當年世界十大科學成就，其中，2001年列在世界十大科學成就第二位，2002年列為世界十大科學成就第一位。2003年美國Fortune(財富)雜志將其與基因重組技術、單克隆抗體技術并稱為生物制藥業三大“金礦”。短短時間里其研究與應用已取得令人鼓舞成果。2006年RNAi技術成果獲得諾貝爾生理學或醫學獎。

RNAi之所以能引起生物醫學界幾乎所有研究空前矚目，是因為siRNA具有強大的抑制靶基因表達效應和高度序列特異性。與抑制基因表達的傳統工具，如反義寡核苷酸、核酶等比較，siRNA沉默基因的效率高達數十倍到數千倍。不僅如此，siRNA本身還是一種極具前景的基因靶向藥物，可廣泛用于諸如癌癥、病毒性疾病等治療。目前，第一個siRNA藥物--針對VEGF基因的siRNA已獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準開始進行一期臨床試驗。

RNA干擾的具體過程是由外源或轉基因、病毒感染等方式引入的dsRNA，在細胞內被RNA酶Dicer以ATP依賴的方式，切割為長21-23核苷酸(nt)、3’端有2個核苷酸突出的雙鏈RNA，即小分子干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)。siRNA同核酸酶等蛋白結合形成RNA誘導基因沉默復合物(RNA?induced?silencing?complex，RISC)。RISC在ATP的作用下將雙鏈siRNA打開成單鏈，與靶基因表達的mRNA的互補位置特異性結合，誘發靶基因mRNA降解，從而在RNA水平上抑制靶基因表達。

RNAi應用研究需要制備19-23nt的siRNA。siRNA制備可采用化學合成法，也可采用載體表達法在細胞內轉錄出靶序列的shRNA，由shRNA在體內自發生成相應siRNA來實現靶基因干擾。體外合成siRNA直接用于靶基因抑制雖然方便快捷，但不穩定，易被RNase降解，產生的基因干擾效應時間短，一般只能維持一周左右時間，且RNA合成價格昂貴，操作亦不如DNA方便，因此其推廣受到局限。載體表達法表達shRNA/siRNA的基本原理是：含有哺乳類RNA聚合酶III啟動子U6或H1的載體，其啟動子在細胞內RNA聚合酶III的特異識別下能啟動轉錄出一種短RNA，當轉錄遇到連續的4～6個T時，轉錄則終止。轉錄出的短RNA其兩端的21個左右的核苷酸反向互補，可形成發夾結構，稱為小發夾RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)。這種小發夾RNA在體內會很快被Dicer酶剪切成為siRNA，從而起到RNA干擾作用。這種方法操作簡便，成本低，與化學合成siRNA相比，DNA載體在體內更穩定，對靶基因的表達抑制效率高，便于進行較長時間的基因功能研究，介導的哺乳細胞特定基因表達抑制率可達95％以上；經過合適的抗藥性篩選，還能獲得shRNA穩定整合于細胞基因組的永久干擾性細胞克隆，獲得特定基因表達被長期抑制的細胞，進而可從表型上進一步研究基因功能，因此近來發展十分迅速。

目前，shRNA載體表達法所用載體分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒作載體雖然載體用量少，轉染效率高，但臨床應用會產生耐藥性，且其臨床安全性一直倍受關注；非病毒載體相對安全，但轉染效率低，載體用量大。Alan?J?Bridge等發現，足夠量的shRNA表達載體也可促發細胞干擾素效應，即使是普通質粒轉染哺乳動物細胞，只要達到一定的用量，也可引起細胞干擾素效應，因此，載體用量有一定限度，這尤其是在某些需要同時抑制兩個或多個基因實驗時載體用量受到的限制就更大。