[發(fā)明專利]一種快速測定青霉素酰化酶酶活的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710048113.9
• 申請日: 2007-11-13
• 公開（公告）號: CN101201356A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張嗣良;施曉疌;儲炬;莊英萍;王永紅;袁中一
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G06F19/00
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶活的檢測方法。

背景技術(shù)

為了解決病菌對青霉素等抗生素抗藥性的提高，人們發(fā)明了人工半合成青霉素等人工抗生素。自從青霉素酰化酶法水解制取6-APA和7-ADCA取代傳統(tǒng)的化學(xué)裂解工藝以來，青霉素酰化酶法成為了目前半合成-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中如頭孢霉素和羥氨芐青霉素的主要生產(chǎn)方法，青霉素酰化酶也從此登上了重要的工業(yè)舞臺。至今國內(nèi)工廠在裂解生產(chǎn)中使用的固定化青霉素酰化酶還有一半是進口商品，所以國內(nèi)研究生產(chǎn)提供青霉素酰化酶是十分重要的。目前世界上用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化青霉素G酰化酶主要來自大腸桿菌和巨大芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)。對它的酶活測定的方法也在不斷地摸索改進中。下面就介紹一下一般青霉素酰化酶的測定方法。

最初，人們以原料青霉素作為底物，酶解得到產(chǎn)物脫苯乙酰生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)，測定單位時間單位體積6-APA的生成量來得到酶活。為了檢測到6-APA，人們發(fā)展了不同的方法如PDAB法等。但馬上都發(fā)現(xiàn)了底物青霉素對各種檢測產(chǎn)物6-APA的方法都有不可忽略的干擾，測量前必須抽提掉青霉素。這樣這種酶活測定的方法不僅步驟繁瑣，而且靈敏度很低。

90年代，有人發(fā)展了熒光檢測法，用熒光胺結(jié)合6-APA。此方法可以極大地降低底物青霉素干擾，并同時因為用熒光檢測使靈敏度提高10⁴倍。可是多肽類物質(zhì)和熒光胺結(jié)合影響嚴重，需調(diào)節(jié)pH至4才能消除影響。這樣使酶活測定環(huán)境大大改變，令它的準確性和可靠性降低。

事實上在青霉素法使用不久后人們便找到了一種替代青霉素的底物：6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)，產(chǎn)物為6-硝基-3-氨基苯甲酸。這種方法不僅解決的底物干擾的問題，而且產(chǎn)物本身是可檢測的淡黃色物質(zhì)，可在波長405nm下用分光光度計檢測濃度。如此，簡化了測量步驟，并使靈敏度較PDAB法上升了三個數(shù)量級以上(約5000倍)。這種方法就是至今仍為主要運用的NIPAB法。NIPAB底物較昂貴，并且它的酶活反應(yīng)不是以青霉素本身為底物，所以很多研究特別是生產(chǎn)上考慮到節(jié)約成本等仍使用青霉素法。要申請的本專利就是基于NIPAB的發(fā)展。以下是傳統(tǒng)的NIPAB法，步驟較繁瑣：

發(fā)酵液離心去上清保留沉淀，沉淀細胞用磷酸緩沖液重懸后采用超聲波、高壓或凍融等細胞破碎法破碎細胞，離心取上清。

取上述上清液20μl加入980μl?50mmol/L?pH7.5的磷酸緩沖液中，37℃保溫。再加入1ml已在37℃下預(yù)熱的0.9mg/ml?NIPAB溶液，精確反應(yīng)4min，加入1ml乙醇終止反應(yīng)。

取上述已終止的反應(yīng)液在分光光度計波長405nm下檢測吸光值。

酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，1min水解1μmol的NIPAB所需青霉素酰化酶為1個酶活力單位U。酶的菌體比活力定義為每升每OD₆₀₀菌體所具有的酶活力單位。

酶活力計算公式：

其中：

t：反應(yīng)時間(min)

p：標準曲線的斜率

V₀：反映體系總體積(ml)

A₄₀₅：樣品光密度讀數(shù)于空白樣品光密度讀數(shù)差

V1：酶液體積(ml)

比色皿厚度默認為1，單位為cm

上述方法步驟繁瑣，給操作帶來極大不便。通常實驗室中為了快速測定少量樣品會不破細胞直接測酶活，但試驗數(shù)據(jù)表明無論有毒性的三氯乙酸還是乙醇都難以徹底終止反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的就是為微生物發(fā)酵生產(chǎn)的青霉素酰化酶提供簡便快捷的酶活測定方法。

本發(fā)明針對原來的NIPAB方法步驟繁瑣的問題，從即可簡化步驟，又不影響檢測效果的角度出發(fā)，提供了一種新的快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步驟：

a)取青霉素酰化酶基因工程菌發(fā)酵液用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋10-50倍；

b)用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液配制NIPAB溶液；

c)取步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液先后加入酶標板，控制反應(yīng)體系中NIPAB的量為過量；

d)在37℃，用酶標儀振動混勻下，在405nm處動態(tài)曲線方式連續(xù)檢測吸光度4-5分鐘，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標獲得動態(tài)反應(yīng)曲線；

e)動態(tài)曲線減去空白板與空白樣后線性回歸得斜率k與截距b。

f)計算酶活：其中酶活力單位為U/L。

其中：