[發明專利]基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法

無效

• 申請號: 200710047953.3
• 申請日: 2007-11-08
• 公開（公告）號: CN101182514A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 劉喜朋;劉建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 毛翠瑩

技術領域

本發明涉及一種新的核酸擴增方法，尤其涉及一種基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，可以用于等溫擴增目標核酸，屬于基因工程技術領域。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是一種有著眾多應用的常規分子生物學技術。常規PCR主要由三步反應組成：1)目標核酸模板分子的熱變性，2)自由引物與變性的目標核酸模板分子間的雜交退火，3)熱穩定性DNA聚合酶催化結合在目標核酸模板分子上的引物的DNA合成反應。常規PCR的三步反應重復循環進行，實現目標核酸的指數倍數擴增。常規PCR需要昂貴的熱循環儀。等溫PCR是一種新型核酸擴增技術，不需要熱循環儀。在等溫PCR中，引物與目標核酸模板分子經變性退火，形成互補配對的引物-模板復合物，在恒定溫度(一般是DNA聚合酶的最適反應溫度)下由DNA聚合酶催化DNA合成反應的持續進行。等溫PCR需要在DNA合成過程中持續地自動生成引物-模板復合物(DNA合成反應的有效底物)，以使DNA合成反應能夠持續進行。由于等溫PCR不依賴于熱循環儀，可以在水浴鍋中進行反應，操作空間大，可以方便的擴大反應體積與通量。

目前常用的等溫PCR主要有兩種：基于滾環復制的等溫PCR和基于loop結構引物的等溫PCR[Nucleic?Acids?Res.，2006，34：e98；Genome?Res.，2001，11：1095-1099；Nucleic?Acids?Res.，2000，28：e63.]。其中基于滾環復制的等溫PCR根據DNA聚合酶的差異，分為phi?29?DNA聚合酶催化的等溫PCR和T7?DNA聚合酶催化的等溫PCR。在phi?29?DNA聚合酶催化的等溫PCR中，正向引物結合于環狀單鏈目標核酸模板分子，在37度下phi?29?DNA聚合酶以滾環復制的形式置換合成長的單鏈DNA，反向引物結合于滾環復制合成的長的單鏈DNA，合成長度各異的雙鏈DNA。與phi?29?DNA聚合酶類似，T7?DNA聚合酶也以環狀DNA為模板，利用正向引物與反向引物，在37度下合成長度各異的眾多雙鏈DNA。基于loop結構引物的等溫PCR以線性DNA為模板，利用4條引物，最終合成各種長度的雙鏈DNA。

現有等溫PCR技術的缺陷主要有：1)擴增產物為長度各異的雙鏈DNA混合物，需要用限制性內切核酸酶消化來形成長度均一的DNA片段；2)phi?29?DNA聚合酶與T7?DNA聚合酶催化的等溫PCR只能擴增長度比較短的環狀目標核酸模板分子，且常常產生非特異性擴增條帶；3)雖然基于loop結構引物的等溫PCR可以擴增高度復雜的線狀DNA分子，但其擴增片段的長度有限，一般低于250?bp；4)基于loop結構引物的等溫PCR需要兩對引物，擴增反應操作復雜，任何一對引物引發的DNA合成反應的失敗均會造成目標核酸擴增的失敗。

發明內容

本發明的目的在于針對現有等溫PCR技術的不足，提供一種基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，該等溫PCR操作簡便，擴增效率、擴增片段長度和特異性大大提高，可用于等溫擴增長度均一的目標核酸片段。

為實現這樣的目的，本發明通過內切核酸酶V與dI修飾引物實現引物-模板復合物的再生。在本發明中，用于擴增目標核酸的正向引物與反向引物具有如下特征：整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5’端第10-30位含有1-5個dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30個核苷酸。等溫PCR反應組分包括dI修飾的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、dATP、dTTP、dCTP、dGTP共4種脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶。等溫PCR混合物經過最初的熱變性、雜交退火后，在恒定溫度下進行PCR。在擴增過程中由內切核酸酶V實現引物-模板復合物的循環再生，引發DNA合成反應；單鏈DNA結合蛋白與解螺旋酶可以提高等溫PCR的目標核酸擴增效率。

本發明方法的具體步驟如下：

1、設計合成用于擴增目標核酸的正向引物與反向引物，正向引物與反向引物的序列特征是：整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5’端第10-30位含有1-5個dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30個核苷酸；