[發明專利]基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法

無效

• 申請號: 200710047953.3
• 申請日: 2007-11-08
• 公開（公告）號: CN101182514A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 劉喜朋;劉建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 毛翠瑩

1.一種基于dI修飾引物和內切核酸酶V的等溫PCR核酸擴增方法，其特征在于包括以下步驟：

1)設計合成用于擴增目標核酸的正向與反向引物序列，正向引物與反向引物的序列特征是：整條引物與目標核酸模板分子完全配對，5’端第10-30位含有1-5個dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30個核苷酸；

2)將用于擴增目標核酸片段的正向引物與反向引物、目標核酸模板分子、以及dATP、dTTP、dCTP、dGTP共四種脫氧核糖核苷三磷酸加入聚合酶鏈式反應緩沖液，配置成無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物；將DNA聚合酶、內切核酸酶V、單鏈DNA結合蛋白和解螺旋酶共四種蛋白質，以1-5個單位：5-500納克：50-10000納克：5-500納克的比例混合，根據四種蛋白質的熱穩定性，配成等溫聚合酶鏈式反應常溫蛋白混合物或等溫聚合酶鏈式反應耐高溫蛋白混合物；

3)將無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至25-37度范圍內放置5分鐘，進行引物與目標核酸模板分子的雜交退火，形成引物-模板復合物；然后加入等溫聚合酶鏈式反應常溫蛋白混合物，于25-37度范圍內進行等溫聚合酶鏈式反應，反應時間1-24小時；

或者，將無蛋白組分的等溫聚合酶鏈式反應混合物與等溫聚合酶鏈式反應耐高溫蛋白混合物直接混合在一起，在95度熱變性5-10分鐘，然后降溫至42-72度范圍內進行等溫聚合酶鏈式反應，反應時間1-24小時；

4)將等溫聚合酶鏈式反應后的混合物置于質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠中，200V條件下電泳20分鐘，檢測目標核酸擴增產物。