[發(fā)明專利]鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710047714.8
• 申請日: 2007-11-01
• 公開（公告）號: CN101182356A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紅梅;李琳;徐斐;胥義;陳佳
• 申請（專利權(quán)）人: 上海理工大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K16/18;C12N5/18
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 寧芝華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鹽酸克倫特羅完全抗原及抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法，該抗體可用于檢測鹽酸克倫特羅在肉類制品及畜類飼料中的殘留量。

背景技術(shù)

鹽酸克倫特羅(CLB)，又名瘦肉精，是一種β₂腎上腺受體激動劑。動物食用后可加速其體內(nèi)脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，所以被不法商販用于飼養(yǎng)豬、牛來提高瘦肉率謀取暴利。但人食用了含有CLB的肉制品后會產(chǎn)生心悸、面頸和四肢肌肉顫動、頭暈、乏力、心律失常等癥狀，嚴(yán)重影響了人民的生活和社會安定。因此，我國已經(jīng)于1997年明令禁止CLB作為飼料添加劑用于禽畜的肉類生產(chǎn)，并制定了相應(yīng)的殘留標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法，即以氣質(zhì)分析(GC-MS)作為確定性方法，高效液相色譜法(HPLC)作為半確定性方法。然而這些方法的靈敏度受樣品的純化、濃縮等步驟的影響大；再者這些方法需要大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所不具備的復(fù)雜儀器，價格昂貴、需要專業(yè)人才操作，不能進(jìn)行現(xiàn)場大批量檢測，且檢測耗時長、檢測費(fèi)用高，不能廣泛使用。近年來利用免疫學(xué)法對畜產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅殘留進(jìn)行檢測是一種極具發(fā)展前途和應(yīng)用前景的新技術(shù)。該方法具有操作簡便、批量檢測、靈敏度高及費(fèi)用低，但該技術(shù)的關(guān)鍵是需要獲得高特異性的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體，目前國內(nèi)已經(jīng)報(bào)道的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體的特異性和親和力都不高，其效價最高也只有10萬左右，其主要原因還在于合成的鹽酸克倫特羅完全抗原立體結(jié)構(gòu)不強(qiáng)，刺激動物機(jī)體不能有效產(chǎn)生高特異性和高親和力的抗體。因此，要獲得高特異性的抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體首先需要一個具有良好免疫原性的抗原鹽酸克倫特羅。但鹽酸克倫特羅分子量僅為313.7，對于分子量小于1000道爾頓的小分子化合物一般不具有免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生特異性抗體，必須與大分子載體連接構(gòu)成有效的人工偶聯(lián)物即合成完全抗原，以突出其分子立體結(jié)構(gòu)的特異性部位即抗原決定簇，才能免疫動物產(chǎn)生針對這一目標(biāo)小分子的特異性抗體。

目前已有的鹽酸克倫特羅完全抗原的制備方法是通過游離的鹽酸克倫特羅與丁二酸酐(即琥珀酸酐)反應(yīng)生成鹽酸克倫特羅半抗原化合物，然后利用碳二亞胺法，將鹽酸克倫特羅半抗原連接到牛血清白蛋白上。該方法的主要缺點(diǎn)是制備繁瑣，需要先制備鹽酸克倫特羅半抗原；在利用碳二亞胺法過程中，需要N，N-二甲基甲酰胺、N-羥基琥珀酰亞胺等易揮發(fā)有機(jī)溶劑，易造成中毒事件，對操作人員健康造成極大危害；在這個過程中會連接一個一定長度的連接臂，在下一步的免疫操作試驗(yàn)中易產(chǎn)生針對連接臂的抗體，不僅影響針對鹽酸克倫特羅抗體的產(chǎn)生，也將影響鹽酸克倫特羅抗體的特異性和親和力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種鹽酸克倫特羅完全抗原及抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的操作步驟繁瑣，危險(xiǎn)試劑，易產(chǎn)生針對其他抗原決定簇的抗體以及產(chǎn)生的抗體特異性和親和力低等缺點(diǎn)。

本發(fā)明是通過重氮法直接在牛血清蛋白上連接上一定數(shù)量的鹽酸克倫特羅分子，制備得到能用于免疫動物的完全抗原CL-BSA，用其免疫Balb/c純系小鼠產(chǎn)生針對鹽酸克倫特羅的特異性抗體，并通過細(xì)胞融合得到穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的細(xì)胞株，最后對該細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)通過純化獲得具有高親和力、高特異性的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體。該單克隆抗體的獲得將為酶聯(lián)免疫等免疫分析技術(shù)提供非常有應(yīng)用價值的材料，從而提高酶聯(lián)免疫等免疫分析技術(shù)檢測鹽酸克倫特羅的靈敏度。

鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述鹽酸克倫特羅完全抗原的制備方法步驟如下：

A)配制1mol/L鹽酸溶液，將其置入4℃冰箱中預(yù)冷；稱取鹽酸克倫特羅(CLB)置于燒杯中，緩慢滴加預(yù)冷的鹽酸溶液，并用玻璃棒攪拌至溶解，然后將溶解完畢的上述溶液放入冰浴鍋中；

B)將冰浴鍋放置于磁力攪拌器上，打開開關(guān)，緩慢攪拌，并向燒杯中逐漸滴加30％亞硝酸鈉(NaNO₂)溶液，滴加NaNO₂溶液時用玻璃棒沾取燒杯中少許液滴，用淀粉KI試紙檢驗(yàn)，待其變化為深紫色時繼續(xù)反應(yīng)45min后，再向燒杯中滴加5％氨基磺酸銨終止反應(yīng)，得到偶氮化的CLB；

C)稱取牛血清白蛋白(BSA)300mg于另一燒杯中，緩慢滴加0.01mol/L、pH＝7.2-7.4的磷酸鹽緩沖夜(PBS)至完全溶解；

D)用滴定管吸取燒杯中偶氮化的CLB溶液，緩慢滴入另一燒杯中溶解的BSA溶液中，玻璃棒攪拌，待反應(yīng)液顏色變?yōu)榱咙S色止；

E)同時向上述混合液中滴加1mol/L?NaOH溶液，使pH值維持在9.0左右，在該燒杯中加入轉(zhuǎn)子后，放置于磁力攪拌器上；