[發(fā)明專利]鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710047714.8
• 申請日: 2007-11-01
• 公開（公告）號: CN101182356A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李紅梅;李琳;徐斐;胥義;陳佳
• 申請（專利權(quán)）人: 上海理工大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K16/18;C12N5/18
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 寧芝華

1.鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述鹽酸克倫特羅完全抗原的制備方法步驟如下：

A)配制1mol/L鹽酸溶液，將其置入4℃冰箱中預(yù)冷；稱取鹽酸克倫特羅(CLB)置于燒杯中，緩慢滴加預(yù)冷的鹽酸溶液，并用玻璃棒攪拌至溶解，然后將溶解完畢的上述溶液放入冰浴鍋中；

B)將冰浴鍋放置于磁力攪拌器上，打開開關(guān)，緩慢攪拌，并向燒杯中逐漸滴加30％亞硝酸鈉(NaNO₂)溶液，滴加NaNO₂溶液時用玻璃棒沾取燒杯中少許液滴，用淀粉KI試紙檢驗，待其變化為深紫色時繼續(xù)反應(yīng)45min后，再向燒杯中滴加5％氨基磺酸銨終止反應(yīng)，得到偶氮化的CLB；

C)稱取牛血清白蛋白(BSA)300mg于另一燒杯中，緩慢滴加0.01mol/L、pH＝7.2-7.4的磷酸鹽緩沖夜(PBS)至完全溶解；

D)用滴定管吸取燒杯中偶氮化的CLB溶液，緩慢滴入另一燒杯中溶解的BSA溶液中，玻璃棒攪拌，待反應(yīng)液顏色變?yōu)榱咙S色止；

E)同時向上述混合液中滴加1mol/L?NaOH溶液，使pH值維持在9.0左右，在該燒杯中加入轉(zhuǎn)子后，放置于磁力攪拌器上；

F)將該燒杯及磁力攪拌器放入冰箱中，打開磁力攪拌器開關(guān)，避光緩慢攪拌24小時，攪拌期間，每間隔1h檢測其pH值，滴加NaOH溶液，使pH值維持在9.0左右；

G)反應(yīng)完畢，將樣品由玻璃棒導(dǎo)流加入透析袋中，置于0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析，3-4h換液一次，透析72h，透析完畢，將得到的鹽酸克倫特羅完全抗原樣品分裝，置于-20℃冰箱中貯藏備用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法，其特征在于：

鹽酸克倫特羅(CLB)小分子經(jīng)過偶氮化過程得到的偶氮化合物分子結(jié)構(gòu)如下：

經(jīng)過與牛血清白蛋白酚羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的鹽酸克倫特羅完全抗原中鹽酸克倫特羅分子與牛血清蛋白的偶聯(lián)率為17，其分子結(jié)構(gòu)如下：

3.鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法，其特征在于單克隆抗體制備方法包括下述步驟：

1)選用6-8周大小、體重18-22g的雌性的純系Balb/c小鼠，免疫劑量基礎(chǔ)免疫為50μg/只，加強免疫為100μg/只；用PBS緩沖液稀釋置備好的鹽酸克倫特羅完全抗原；初次免疫時加入等體積的福氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不擴散，采用腹腔注射方法；2-3周后進行加強免疫，以后每隔兩周再次進行加強免疫，加強免疫時采用福氏不完全佐劑；從第三次免疫開始，每次免疫第三天進行眼眶采血，測定效價及特異性；待免疫血清效價合格后，準備進行細胞融合；

2)通過間接酶聯(lián)免疫法(IELISA)檢測到合格血清后，將該小鼠取脾臟破碎成單個的細胞懸液與SP2/0骨髓瘤細胞按照3-10∶1的比例混勻，離心去掉上清液；使用用PBS緩沖液溶解的質(zhì)量體積比為50％的聚乙二醇4000加入到混勻的細胞中進行融和1min，融合過程中，對融合液緩慢搖勻；

3)融合完畢后，將融合細胞加入HAT培養(yǎng)基中，并將該細胞培養(yǎng)液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，置于5％CO₂?37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；兩周后用HT培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并對細胞培養(yǎng)液上清進行IELISA檢測，最終篩選得到高特異性雜交瘤細胞株，經(jīng)過四次體外傳代和凍存復(fù)蘇，細胞生長良好，并穩(wěn)定分泌抗體，其效價大于3×10⁶；

4)取6-8周Balb/c小鼠，按照1ml/只向其腹腔注射液體石蠟，七天后腹腔接種處于生長對數(shù)期的雜交瘤細胞，每只注射1×10⁶個，間隔三天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待其腹部變大，毛發(fā)稀疏，瀕死不動時，采集得到6mL腹水，將腹水離心，得到5mL的上清，然后加入50g/100mL的硫酸銨法，離心后得到沉淀即為抗鹽酸克倫特羅的單克隆抗體，將其用適量的PBS緩沖溶液溶解，分裝后放置于-20度冰箱中長期保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽酸克倫特羅完全抗原及其單克隆抗體的制備方法，其特征在于：

單克隆抗體通過試劑盒檢測確定該抗體的亞型為IgG1，其輕鏈為κ。