[發(fā)明專利]重組人血管內皮細胞生長因子的分離純化、體外化學標記及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710047352.2
• 申請日: 2007-10-24
• 公開（公告）號: CN101418042A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 周群敏;羅師平;周青;陶飛龍;胡紅群;謝鳳娟
• 申請（專利權）人: 蘇州思坦維生物技術有限責任公司
• 主分類號: C07K14/475
• 分類號: C07K14/475;C07K1/14;C12N15/09;C12N15/12;G01N33/68;G01N33/53;C12N5/08
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術鄰域。本發(fā)明涉及以重組基因工程及親和層析柱技術來制備及分離提純具生物活性的重組VEGF蛋白；本發(fā)明還涉及對純化的重組VEGF蛋進行體外非放射性化學偶聯標記處理的方法。本發(fā)明的VEGF蛋白(包括化學偶聯標記的或未標記的)在實驗研究及臨床上具有廣泛的用途。

背景技術

血管新生或增生(angiogenesis)在生物學上是指體內的已存在的血管(如毛細血管和小靜脈)通過出芽或分裂的方式而產生新的血管的過程。血管新生在維持機體的許多正常的生理過程如組織胚胎發(fā)育、外傷傷口的癒合與修復等是有益的和必需的。但過度的血管新生或增生也與許多病理變化(如腫瘤的增生擴散，炎癥)息息相關。體內的血管能夠不斷地增生與增長的關鍵是其內襯的血管內皮細胞具有不斷分裂增生及定向遷移置入已有的血管管壁的能力。

血管內皮細胞的分裂/增生依賴于血管內皮細胞生長因子(vascular?endothelialgrowth?factor，即VEGF)(Napoleone?Ferrara：2004，Vascular?Endothelial?Growth?Factor：Basic?Science?and?Clinical?Progress。Endocrine?Reviews?25(4)：581-611)。VEGF在血管增生中的重要性也已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被證實：如只要當VEGF基因中的一份被敲除，其胚胎中的新生血管即無法正常形成進而導致胚胎死亡。

人VEGF的基因全長為14kb，由8個外顯子，7個內含子組成。其中由于其mRNA不同的剪接，體內至少存在有6種不同形式的VEGF蛋白(即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206，其中研究最多的是VEGF165)。這6種VEGF蛋白以同源二聚體可溶性糖蛋白形式存在細胞外間質或體液中，通過與特異表達在血管內皮細胞上的VEGF受體(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)的高度結合，從而介導出刺激血管內皮細胞分裂增生的活性。

但是體內天然的VEGF含量低且半衰期短，故一般很難提取與分離到足夠量的天然的VEGF蛋白以滿足實驗研究及臨床應用的需要。以重組基因工程及細胞培養(yǎng)或細菌發(fā)酵技術來體外大量表達生產重組的VEGF蛋白則是解決該問題的理想方案。但鑒于VEGF蛋白富含二硫鍵(S_S)結構，而二硫鍵對維持其三級結構及生物學活性起重要作用，故重組VEGF蛋白的表達生產策略將以在真核細胞中的分泌性表達最為理想。常見的真核表達宿主包括：哺乳動物細胞、昆蟲細胞及酵母細胞等。但已有的研究表明以哺乳動物細胞表達重組VEGF蛋白，其生產成本高，不宜達到工業(yè)化規(guī)模生產。而真核單細胞生物中的酵母細胞(菌)表達系統由于兼有原核細胞的生長快速，培養(yǎng)方便經濟，生產成本低廉，和真核細胞系統的對表達產物的加工修飾的雙重特點，則是工業(yè)化生產表達外源基因如VEGF蛋白的最理想宿主。其中，近年來應用較為廣泛的宿主細胞是以Pichia.pastoris(畢赤巴斯德酵母)代表的甲基營養(yǎng)型酵母(methylotrophic?yeast)。

以畢赤酵母表達人血管內皮細胞生長因子的方法目前已有一些報導。如馬驪等在2000年報導(文獻1：馬驪張智清陳愛君姚立紅姜忠良王小寧：人血管內皮生長因子在畢赤酵母菌中的表達和鑒定。中華實驗和臨床病毒學雜志2000?Vol.14No.4P.309-312)：利用聚合酶鏈反應(PCR)技術，擴增出hVEGF165基因片段，并克隆于含AOX1啟動子和α分泌信號肽序列的Pichia.pastoris酵母載體中，構建重組表達質粒pPIC9K/hVEGF165，轉化酵母宿主菌KM71，篩選多拷貝整合轉化子，搖瓶培養(yǎng)，1％甲醇誘導表達，獲得高效表達且具有生物學活性的重組VEGF165。