[發(fā)明專利]重組人血管內(nèi)皮細胞生長因子的分離純化、體外化學標記及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710047352.2
• 申請日: 2007-10-24
• 公開（公告）號: CN101418042A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 周群敏;羅師平;周青;陶飛龍;胡紅群;謝鳳娟
• 申請（專利權）人: 蘇州思坦維生物技術有限責任公司
• 主分類號: C07K14/475
• 分類號: C07K14/475;C07K1/14;C12N15/09;C12N15/12;G01N33/68;G01N33/53;C12N5/08
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1.一種以重組基因工程及免疫親和層析技術來制備及分離提取重組人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)蛋白的方法，其特征在于其包括下列步驟：

1)以多聚酶鏈式反應(RT-PCR)從健康人細胞組織中克隆獲得含編碼人VEGF蛋白質(zhì)的cDNA；

2)克隆擴增獲得的cDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后，再用T4連接酶將其與經(jīng)相應的限制性內(nèi)切酶處理的表達載體相連，獲得重組表達載體；

3)將上述重組表達載體轉入真核宿主細胞，經(jīng)篩選、擴增培養(yǎng)后獲得高效穩(wěn)定分泌表達重組人VEGF蛋白的宿主細胞；

4)收集細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)離心及以濾膜過濾后，將濾液直接上樣至含有偶聯(lián)有VEGF受體蛋白或抗-VEGF抗體蛋白的親合層析柱中；

5)親合層析柱先經(jīng)PBS洗脫后，再以低pH液洗脫回收被吸附的蛋白；

6)洗脫回收的蛋白再經(jīng)調(diào)節(jié)pH至中性及透析與理化鑒定后，即獲得純化的重組人VEGF蛋白。

2.如權利要求1所述的制備及分離提取重組人VEGF蛋白的方法，其特征在于所述的用于表達重組人VEGF蛋白的真核宿主細胞包括但不局限于動物細胞、昆蟲細胞及酵母細胞等。

3.如權利要求1所述的制備及分離提取重組人VEGF蛋白的方法，其特征在于所述的偶聯(lián)于親合層析柱中的VEGF受體蛋白包括但不僅限于：天然的可溶性VEGF受體(VEGF-R1、VEGF-R2及VEGF-R3)蛋白、含VEGF結合區(qū)的VEGF受體蛋白片段及重組的含VEGF結合區(qū)的VEGF受體融合蛋白等。

4.如權利要求1所述的制備及分離提提取重組人VEGF蛋白的方法，其特征在于所述的偶聯(lián)于親合層析柱中的抗-VEGF抗體蛋白包括但不僅限于：可結合人VEGF蛋白的單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體或含可結合人VEGF蛋白的抗體蛋白片段等。

5.一種帶有生物素(Biotin)標記物的VEGF蛋白，其特征在于該標記的VEGF蛋白多肽中偶聯(lián)有一個或多個生物素，并保持有VEGF及生物素(Biotin)的雙重活性，可同時與VEGF受體結合及與親和素(Avidin)結合。

6.一種制備如權利要求5所述的帶生物素標記的VEGF蛋白的方法，其特征在于該標記方法包括下列步驟：

1)溶解VEGF蛋白質(zhì)于pH為7-9的緩沖液中；

2)按標記試劑與VEGF蛋白的反應摩爾比在10：1至50：1間，加入適量的活化的生物素標記試劑與VEGF蛋白樣品混合，并混勻，室溫反應30-60分鐘；

3)通過透析或脫鹽去除未反應的過量生物素，得到生物素標記的VEGF蛋白。

7.一種以權利要求5所述的生物素標記的VEGF蛋白為主要試劑成分進行體外檢測細胞或組織中的VEGF受體(VEGF-R)表達的方法，其特征在于其包括下列步驟：

1)待檢細胞或組織切片以含牛血清白蛋白的封閉液溫育封閉；

2)在待檢細胞或組織切片上滴加經(jīng)適度稀釋的生物素標記的VEGF蛋白，溫育1-2小時；

3)用緩沖液洗滌樣品，再滴加經(jīng)適度稀釋的酶標記的親和素(Avidin)，溫育30-60分鐘；

4)用緩沖液洗滌樣品，再滴加底物，溫育5-10分鐘或至顯色；顯色反應結束，于顯微鏡下判讀檢測結果。

8.一種以權利要求5所述的生物素標記的VEGF蛋白為主要試劑成分進行體外檢測流離的可溶性VEGF受體(VEGF-R)的方法，其特征在于其包括下列步驟：

1)用抗人VEGF受體的抗體或其他可結合VEGF受體的配體包被ELISA板；

2)經(jīng)PBS液洗脫及以含牛血清白蛋白的封閉液溫育后，加入待檢的樣品，溫育1-2h；

3)經(jīng)PBS-T液洗脫后，加入經(jīng)適度稀釋的生物素標記的VEGF蛋白，溫育1-2h；

4)經(jīng)PBS-T液洗脫后，再加入經(jīng)適度稀釋的酶標記的親和素(Avdin)，溫育1-2h；

5)經(jīng)PBS-T液洗脫后，加入顯色底物液，室溫5-30min，或至顯色；

6)加入終止反應液，以酶聯(lián)免疫儀測定各孔的吸光值；根據(jù)OD值并與正常參照物(重組可溶性VEGFR受體蛋白)比較，計算出待檢測的樣品中所含流離的或可溶性VEGF受體蛋白的水平。