[發明專利]日本血吸蟲膜蛋白基因TSP2的克隆、表達和應用

無效

• 申請號: 200710046635.5
• 申請日: 2007-09-29
• 公開（公告）號: CN101397558A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 傅志強;林矯矯;王欣之;姚利曉;苑純秀;楊健美;劉金明;馮新港
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N1/21;C12N15/30;A61K48/00;A61P33/12;C12R1/19
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王 巍

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及日本血吸蟲膜蛋白基因TSP2(四跨膜蛋白2)的克隆、表達和應用。

背景技術

血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。對其治療藥物具有一定的付作用，因而防治工作很重要，抗血吸蟲病疫苗研究成為血吸蟲病防治研究的熱點之一。

血吸蟲長期寄生在血管內，它的體表與宿主血液直接接觸，血吸蟲表膜(包括酶、表面暴露分子、受體等)是宿主免疫系統與血吸蟲蟲體接觸的界面，完整的膜蛋白分子在血吸蟲與宿主相互作用中及對血吸蟲逃避宿主的免疫攻擊和血吸蟲在宿主血管內生存的適應性等方面均起著重要作用。因此對血吸蟲表膜相關蛋白的研究不僅可以了解血吸蟲與宿主相互作用中的關鍵因子，而且也有助于深入探討血吸蟲免疫逃避機制，發現新的、高效的疫苗候選抗原。

東方田鼠(Microtus?fortis)在分類學上隸屬于嚙齒目倉鼠科(Cricetidae)田鼠亞科(Microtinae)田鼠屬(Microtus)，分布于中國西北、東北及南方16個省區，是血吸蟲病流行區洞庭湖洲上廣泛分布的一個優勢鼠種。東方田鼠是至今在中國血吸蟲病疫區發現的唯一一種感染日本血吸蟲尾蚴后不致病的哺乳類動物。近年來研究證實，日本血吸蟲流行區野生東方田鼠、非日本血吸蟲流行區野生東方田鼠和室內繁殖的東方田鼠均具有抗日本血吸蟲病現象。為探討東方田鼠抗日本血吸蟲感染機制，將新鮮東方田鼠血清通過尾靜脈注射被動轉移給昆明系小鼠后，與對照組比較，小鼠體內血吸蟲蟲荷、糞便蟲卵數、毛蚴孵出率，均顯著減少。為進一步研究東方田鼠血清中哪些成分和因子與東方田鼠抗日本血吸蟲感染相關，以ELISA方法檢測東方田鼠抗血吸蟲可溶性童蟲抗原不同亞型的抗體，結果提示體液免疫在東方田鼠抗血吸蟲病中發揮了重要作用，抗體可能是東方田鼠血清中抗日本血吸蟲病的重要成分。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于根據東方田鼠對日本血吸蟲感染具有天然抵抗力這一特性，利用重復攻擊感染日本血吸蟲尾蚴的東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲成蟲cDNA表達文庫，獲得一個日本血吸蟲SjTSP2基因，并對其編碼蛋白的結構和功能進行了生物信息學分析，在此基礎上構建了含SjTSP2基因第二個膜外區(EM2)的原核表達質粒SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2，并在大腸桿菌表達體系中表達得到了融合蛋白SjTSP2EM2/HIS和SjTSP2EM2/GST。

本發明對日本血吸蟲膜蛋白基因TSP2進行小鼠日本血吸蟲病免疫保護試驗。

本發明應用東方田鼠兩次感染日本血吸蟲尾蚴后采集的血清免疫篩選日本血吸蟲(中國大陸株)成蟲cDNA文庫，獲得一陽性克隆，利用NCBI的Blast進行基因序列的同源性分析，表明該基因為日本血吸蟲膜蛋白TSP2基因。該基因ORF含645個堿基對，編碼215個氨基酸。生物信息學分析表明，SjTSP2基因推導氨基酸序列的N端含有信號肽，并有4個跨膜區和2個膜外區，符合四跨膜蛋白家族的主要特征。該蛋白第二個膜外區(EM2)具有多個功能位點，抗原性分析表明其具有較強的抗原性。

在此基礎上，將SjTSP2基因第二個膜外區DNA片段克隆至原核表達質粒pET28c和pGEX-4T-2，構建重組表達質粒SjTSP2EM2/pET28c和SjTSP2EM2/pGEX-4T-2，轉化Rossetta(DE3)表達菌后，用IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳分析顯示，重組質粒獲得高效表達，融合蛋白rSjTSP2EM2/HIS、rSjTSP2EM2/GST分子量分別為15KD和36KD。

本發明提供了日本血吸蟲膜蛋白基因TSP2在大腸桿菌中的克隆和表達。具體包括下列步驟：

(1)根據SjTSP2第二個膜外區SjTSP2EM2兩端序列設計引物，并在其擴增序列的5′端和3′端分別引入EcoR?I和Sal?I酶切位點，通過PCR擴增得到含第二個膜外區(EM2)SjTSP2EM2的基因片段；

(2)將SjTSP2EM2的基因定向克隆至原核表達載體pET28c(+)及pGEX-4T-2的多克隆位點區，構建重組原核表達質粒SjTSP2EM2/pET28c及SjTSP2EM2/pGEX-4T-2；