[發明專利]一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 200710046231.6
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101157896A
• 公開（公告）日: 2008-04-09
• 發明（設計）人: 周祥山;張元興;倪振華
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;山東東阿阿膠股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/57;C12N9/50;C12R1/84
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 王潔

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體地，涉及重組畢赤酵母菌株，特別是指一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株及其構建方法。

背景技術

水蛭素是迄今為止所發現最強的天然的凝血酶特異抑制劑。動物試驗與臨床研究表明，水蛭素能高效阻止血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應等進一步血瘀現象。與肝素相比，它不僅用量少，不會引起出血，也不依賴于內源性輔助因子；而肝素則有引起出血的危險，在彌漫性血管內凝血的發病過程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，采用水蛭會有較好的效果。因此水蛭素可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療；也可用于外科手術后預防動脈血栓的形成，預防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環和血液透析過程。

1996年，Rosenfeld等首次在畢赤酵母中分泌表達了水蛭素蛋白，產量達到1.5g/L(Rosenfeld?SA等，Protein?Expr.Purif.1996，8：476-482)，但是在其文章中沒有提到水蛭素的降解問題。2002年張元興、周祥山、周衛斌等在重組畢赤酵母發酵分泌表達水蛭素時，發現雖然水蛭素的總產量比較高，但在發酵過程中水蛭素存在降解現象，發酵過程中產生了4種具有較高比活的水蛭素異構體，它們分別是目的產物水蛭素Hir65及Hir65的C-末端降解1-3個氨基酸的產物(Zhou?XS等，Biotechnol.Lett.2002，24：1449-1453；Zhou?WB等，Preparative?Biochemistry?Biotechnology?2004，34(3)：239-252)。這說明在畢赤酵母中存在一些降解水蛭素的蛋白酶，而且這些蛋白酶對水蛭素的降解程度是比較厲害的，嚴重影響了水蛭素Hir65的產量，并影響了下游純化。

發明內容

本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株及其構建方法，該菌株能有效減少發酵過程中水蛭素的降解，提高水蛭素的產量，并有助于下游的純化，使得生產成本降低。

在本發明的第一方面，提供了一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株，其特點是，所述重組畢赤酵母菌株中含有失活的KEX1基因。

相對于未失活的KEX1基因，所述的失活的KEX1基因的編碼區及非編碼區插入了或缺失了DNA片段。

所述的失活的KEX1基因的編碼區缺失了第289～1728位堿基序列，其編碼的蛋白酶缺失了第97～576位氨基酸。

采用所述重組畢赤酵母菌株表達水蛭素的發酵過程中，完整水蛭素占總水蛭素的比例達到了60％～90％，完整水蛭素產量達到了2.9g/l。

在本發明的第二方面，提供了一種制備上述重組畢赤酵母菌株的方法，其特點是，包括步驟：使一種畢赤酵母菌株含有的未失活的KEX1基因失活，從而獲得所述重組畢赤酵母菌株。

在所述的未失活的KEX1基因的編碼區及非編碼區插入或缺失DNA片段。

采用Pop-In/Pop-Out的方法缺失了所述的未失活的KEX1基因編碼區的第289～1728位堿基序列，即缺失了其編碼的蛋白酶的第97～576位氨基酸。

較佳地，包括步驟：

a.構建KEX1基因體外缺失片段；

b.構建含sh?ble基因的pPOPBle載體；

c.將所述KEX1基因體外缺失片段插入所述pPOPBle載體，獲得pPOPBleΔkex1載體；

d.線性化所述pPOPBleΔkex1載體，轉化畢赤酵母菌GS115Hir。

本發明提供了的KEX1基因缺失的重組畢赤酵母菌株GS115HirΔkex1，采用該菌株表達水蛭素Hir65蛋白，在發酵誘導初期完整水蛭素占總水蛭素的比例達到了90％，到發酵結束時也高于60％。而在相同的發酵條件下，KEX1基因未失活的畢赤酵母菌株中，完整水蛭素占總水蛭素的比例一直只有40％左右。發酵結束后在KEX1基因失活的畢赤酵母菌株中完整水蛭素產量達到了2.9g/l，而在KEX1基因未失活的畢赤酵母菌株中只有1.1g/l。所述本發明的KEX1基因缺失的重組畢赤酵母菌株能有效抑制水蛭素降解，水蛭素表達量顯著提高，這樣的結果并有助于下游的純化，使得生產成本降低。

附圖說明

圖1a為制備本發明的一具體實施例時擴增出的部分Δkex1片段的電泳示意圖一。

圖1b為制備本發明的一具體實施例時擴增出的Δkex1片段的電泳示意圖二。