[發明專利]表達重組人凝血因子VII的畢赤酵母及其制法和應用

無效

• 申請號: 200710045279.5
• 申請日: 2007-08-27
• 公開（公告）號: CN101376875A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發明（設計）人: 朱威;樓覺人;蔡蓓蓓
• 申請（專利權）人: 上海生物制品研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/12;C12N15/55;C07K14/745;C12N9/74;A61K38/17;A61K38/46;A61P7/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及生物工程和免疫領域，具體而言涉及一種表達重組人凝血因子VII的酵母細胞、用于轉化酵母細胞的構建物以及它們的構建方法和應用。

背景技術

凝血因子VII(FVII)是一個維生素K依賴性的具有絲氨酸蛋白水解酶作用的酶原，它主要在肝臟中合成。血漿中的大部分FVII是單鏈無活性的酶原，濃度為0.5ug/ml(10nmol/l)的濃度。血漿中具有痕量的活化FVIIa，濃度為10-110pmol/l。

在血管受損后，組織因子(TF)暴露，FVII或活化FVII(FVIIa)能與TF形成復合物，并在FXa、凝血酶等作用下，在FVII鏈的精氨酸152和異亮氨酸153位點處裂解成雙鏈而被活化。原丙氨酸1～精氨酸152位的殘基組成FVIIa的輕鏈，分子量為20kD；異亮氨酸153～脯氨酸406位的殘基組成FVIIa的重鏈，分子量為30kD。輕鏈和重鏈由一個二硫鍵連接(135和262位半胱氨酸間的二硫鍵)。

自凝血瀑布學說提出以來，FVII一直被看作外源性凝血途徑的起始酶。在鈣離子、磷脂存在的條件下，FVIIa可與組織因子(TF)結合形成復合物(FVIIa-TF)，并將FX活化為FXa。隨即相繼激活凝血酶原和纖維蛋白原，導致血凝塊形成。

以后的研究還發現FVIIa-TF可激活FIX。大量的研究結果證明FVIIa激活FIX的途徑與激活FX的途徑具有同等重要的意義。FVIIa除通過活化FX啟動凝血瀑布外，還通過活化FIX放大凝血的酶促反應。從而在血凝塊生成的內、外途徑中均扮演了必不可少的角色。

傳統的血源性FVIIa因含量低，并有傳播血液傳染病的危險，從而迫使人們轉向基因重組產品。重組凝血因子VIIa(rFVIIa)在1999年由美國FDA批準上市，用于治療血友病及伴有抑制物患者的出血治療。此后rFVIIa被證明能增加已被激活的血小板上凝血酶的生成，可用于血小板減少癥及血小板功能障礙患者出血時的治療。rFVIIa也被證實可以成功地用于治療手術時的急性出血情況。因此rFVIIa在臨床止血方面的應用越來越受到人們的重視。

目前市場上只有丹麥的Novo公司用倉鼠腎細胞(BHK)表達出rFVIIa，經純化后制備的產品價格比較昂貴。本領域迫切需要為患有威脅生命的凝血系統缺陷病人以及手術期大量失血的患者開發出新的低成本的治療性重組FVII。

雖然目前已發展了多種蛋白質表達系統來生產生物體的外源蛋白，比如大腸埃希氏菌表達系統，酵母表達系統，高等真核細胞表達系統等，但這些系統仍存在某些有待改進的缺陷。

例如大腸桿菌作為宿主可表達多種蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻譯后的修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；(2)表達的蛋白多形成不溶性包涵體，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性；(3)菌體蛋白較不利于純化等缺點。

而釀酒酵母系統也具有局限性：(1)產量通常較低；(2)表達質粒易于丟失；(3)缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子；(4)外源蛋白過度糖基化修飾會嚴重的改變蛋白質的免疫原性、降低活性、縮短滯留時間；(5)分泌效率差，純化困難。

為了克服以上系統的這些缺點，人們一方面不斷地表達系統進行改造和完善，另一方面也在尋找一些可替代釀酒酵母的其他非傳統酵母。其中以嗜甲醇酵母研究得最多。

嗜甲醇酵母是指能夠利用甲醇作為唯一的碳源和能源的酵母。這類酵母菌分為四屬：念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Picha)以及球擬酵母屬(Torulopsis)。

如何應用這些新的表達系統來高效表達所需目的基因，也是本領域中急需摸索和研究的問題。而在重組蛋白表達領域，要獲得高表達量的表達載體更是取決于眾多因素。例如所表達蛋白質的性質、所采用的表達方式有關、所采用的表達盒中的各元件、表達盒中各元件的組合方式、高拷貝克隆中各拷貝的排列方式等。

綜上所述，本領域仍然迫切需要開發出成本更低廉、步驟更簡便、表達量更高的FVII生產方法。

發明內容

本發明的目的正是提供一種穩定高表達FVII的酵母細胞及其制備方法，由此提高FVII的表達量及產量。

在本發明的第一方面，提供了一種表達人凝血因子VII的酵母細胞，所述酵母細胞的染色體中整合有表達人凝血因子VII的構建物，所述構建物含有2-15個串聯排列的人凝血因子VII表達盒，每個所述人凝血因子VII表達盒從5’到3’依次包括以下元件：