[發(fā)明專利]表達(dá)重組人凝血因子VII的畢赤酵母及其制法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710045279.5
• 申請(qǐng)日: 2007-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN101376875A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱威;樓覺人;蔡蓓蓓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海生物制品研究所
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/12;C12N15/55;C07K14/745;C12N9/74;A61K38/17;A61K38/46;A61P7/04
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐迅

1.一種表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞的染色體中整合有表達(dá)人凝血因子VII的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有2-15個(gè)串聯(lián)排列的人凝血因子VII表達(dá)盒，每個(gè)所述人凝血因子VII表達(dá)盒從5’到3’依次包括以下元件：

(a)起始信號(hào)元件AOX；

(b)人凝血因子VII基因；和

(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)；

并且所述酵母細(xì)胞在誘導(dǎo)下表達(dá)具有凝血活性的人凝血因子VII。

2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞選自：畢赤酵母、釀酒酵母、球擬酵母、或漢遜酵母。

3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞，其特征在于，人凝血因子VII基因包含SEQ?ID?NO：1所示的序列。

4.一種酵母細(xì)胞群，其特征在于，所述的細(xì)胞群中90-100％的酵母細(xì)胞是權(quán)利要求1所述的表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞，并且90-100％所述酵母細(xì)胞中人凝血因子VII表達(dá)盒的拷貝數(shù)是相同的或基本相同的。

5.一種制備重組人凝血因子VII的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(i)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的表達(dá)重組人凝血因子VII的酵母細(xì)胞，從而表達(dá)重組人凝血因子VII；和

(ii)從培養(yǎng)物中分離出重組人凝血因子VII。

6.一種重組人凝血因子VII，其特征在于，所述重組凝血因子VII是通過權(quán)利要求5所述的方法制備的。

7.如權(quán)利要求6所述的重組人凝血因子VII的用途，其特征在于，用于制備促凝血的藥物組合物。

8.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物含有2-15個(gè)串聯(lián)排列的人凝血因子VII表達(dá)盒，每個(gè)所述人凝血因子VII表達(dá)盒從5’到3’依次包括以下元件：

(a)起始信號(hào)元件AOX；

(b)人凝血因子VII基因；和

(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)。

9.一種構(gòu)建權(quán)利要求8所述的構(gòu)建物的方法，其特征在于，當(dāng)所述構(gòu)建物為多拷貝表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，所述方法包括：

(1)將人凝血因子VII基因定點(diǎn)插入包含起始信號(hào)元件AOX和終止信號(hào)元件AOX(TT)的質(zhì)粒中，以獲得單拷貝表達(dá)質(zhì)粒；

(2)對(duì)所述單拷貝表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造以獲得完整的人凝血因子VII表達(dá)盒，其中，所述表達(dá)盒從5’到3’依次包含以下元件：

(a)起始信號(hào)元件AOX；

(b)人凝血因子VII基因；和

(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)；

(3)將所述人凝血因子VII表達(dá)盒重復(fù)插入所述質(zhì)粒中，從而獲得含有2-15個(gè)串聯(lián)排列的人凝血因子VII表達(dá)盒的構(gòu)建物。

10.一種權(quán)利要求1所述的表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟：用權(quán)利要求5所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，使所述的構(gòu)建物整合入酵母染色體中，從而獲得權(quán)利要求1所述的表達(dá)人凝血因子VII的酵母細(xì)胞。