[發(fā)明專利]一種利用FPLC測(cè)定脫氧胞苷激酶(dCK)活性方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710044731.6
• 申請(qǐng)日: 2007-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN101201338A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱利民;柴艷倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89;C12Q1/00
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種酶活力測(cè)定方法，具體涉及一種脫氧胞苷激酶(dCK)的酶活測(cè)定方法。

背景技術(shù)

脫氧胞苷激酶(dCK)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的四大激酶之一，它廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)及一些細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞體內(nèi)，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷類藥物的磷酸化。研究表明，抗病毒核苷類藥物在人體內(nèi)通過dCK催化進(jìn)行磷酸化，產(chǎn)生與逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合的底物，而發(fā)揮藥效。但是，在一些患者體內(nèi)細(xì)胞的dCK含量很低，無法催化核苷類藥物的磷酸化，因而導(dǎo)致了病毒的抗藥性。因此，利用從各種來源提取dCK，并將其用于核苷類似物的體外磷酸化，對(duì)核苷類藥物的發(fā)展來說是一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。故對(duì)于從各種來源純化的dCK進(jìn)行酶活表征，是利用dCK進(jìn)行催化反應(yīng)的重要步驟。

自1970年以來，有多個(gè)專家對(duì)于dCK的酶活測(cè)定方法進(jìn)行了研究，主要有：放射性同位素薄層層析色譜法、放射性同位素連續(xù)分光光度法以及非放射性反相HPLC色譜法。其中，放射性同位素薄層層析色譜法的發(fā)明年代較早，對(duì)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室測(cè)量來說是落后且費(fèi)時(shí)的；放射性同位素連續(xù)分光光度法雖然是第一種方法的改進(jìn)，但是同樣也需要用到放射性同位素，大大增加了時(shí)間上和經(jīng)濟(jì)上的成本；而非放射性反相HPLC色譜法是2004年發(fā)表的利用高效液相色譜進(jìn)行dCK酶活測(cè)定的一種新方法，簡(jiǎn)單易懂，簡(jiǎn)化了以往的復(fù)雜操作，但是其對(duì)液相色譜柱要求較高。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用非放射性反相HPLC色譜法，在相同條件下進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，所得的結(jié)果存在差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不夠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種脫氧胞苷激酶(dCK)酶活測(cè)定方法，該方法克服了以往的dCK酶活測(cè)定方法的繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，重復(fù)性不高的缺陷。

本發(fā)明的利用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)測(cè)定dCK酶活的方法，包括如下步驟：

(1)將反應(yīng)混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)后，加入冰甲醇終止反應(yīng)，冰浴后，離心，取上清液；

(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進(jìn)行層析，通過與空白對(duì)比測(cè)得CdA減少的量，計(jì)算dCK的活性。

所述步驟(1)中的反應(yīng)液包括：2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化鎂MgCl₂、氯化鈉NaCl、氟化鈉NaF、二硫代蘇糖醇DTT、dCK，濃度分別為0.1～1mmol/LCdA、1～10mmol/L?UTP、1～10mmol/L?MgCl₂、10～20mmol/L?NaCl、10～20mmol/L?NaF、1～2mmol/L?DTT，優(yōu)選1mmol/L?CdA、10mmol/L?UTP、10mmol/L?MgCl₂、20mmol/L?NaCl、20mmol/L?NaF、2mmol/L?DTT。

所述步驟(1)中的反應(yīng)液用0.005～0.02mol/L的Tris-HCl(pH6.0～8.0)溶液定容，優(yōu)選0.01?mol/L的Tris-HCl(pH7.4)；

所述的脫氧胞苷激酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK；

所述步驟(1)中的反應(yīng)是指30℃～40℃，120～150轉(zhuǎn)條件下，反應(yīng)2～3小時(shí)，反應(yīng)后冰浴5～20分鐘，優(yōu)選37℃，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)后冰浴10分鐘；

所述的步驟(2)中的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE^TM?RPC?1ml，洗脫液A為0.05～0.02mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH6.0～8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5～10個(gè)柱床，沖洗為5～7個(gè)柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10～20個(gè)柱床內(nèi)由0％線性增加至100％，流速為1～2ml，優(yōu)選洗脫液A為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為10個(gè)柱床，沖洗為7個(gè)柱床，洗脫梯度為洗脫液B在20個(gè)柱床內(nèi)由0％線性增加至100％，流速為1ml；

所述的dCK酶活的計(jì)算方法：dCK酶活U＝CdA反應(yīng)量(picomol)/蛋白含量(μg)·h，CdA反應(yīng)量＝CdA空白標(biāo)準(zhǔn)量-CdA剩余量；

所述的CdA剩余量的測(cè)定為內(nèi)標(biāo)法。

本發(fā)明提供的方法快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果可信，重復(fù)性高，為大批量測(cè)定氧胞苷激酶(dCK)酶活，提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應(yīng)混合液空白進(jìn)行反相色譜層析所得的色譜圖；

圖2為用快速蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)對(duì)小牛胸腺dCK催化CdA磷酸化反應(yīng)混合液進(jìn)行反相色譜層析所得的色譜圖。