[發(fā)明專利]一種利用FPLC測定脫氧胞苷激酶(dCK)活性方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710044731.6
• 申請日: 2007-08-09
• 公開（公告）號: CN101201338A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發(fā)明（設計）人: 朱利民;柴艷倩
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89;C12Q1/00
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.利用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(FPLC)測定脫氧胞苷激酶(dCK)酶活的方法，包括如下步驟：(1)30℃～40℃，將反應混合液放入氣浴/水浴恒溫振蕩器中，120～150轉(zhuǎn)/min，反應2～3小時，加入冰甲醇終止反應，冰浴5～20分鐘后，離心，取上清液；

(2)用Tris-HCl緩沖液稀釋上清液，過濾，利用FPLC的反相液相色譜柱進行層析，通過與空白對比測得CdA減少的量，計算dCK的活性。

2.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的反應液包括：2-氯-2-脫氧胞苷(CdA)、三磷酸尿苷(UTP)、氯化鎂MgCl₂、氯化鈉NaCl、氟化鈉NaF、二硫代蘇糖醇DTT、dCK，濃度分別為0.1～1mmol/L?CdA、1～10mmol/L?UTP、1～10mmol/L?MgCl₂、10～20mmol/L?NaCl、10～20mmol/L?NaF、1～2mmol/L?DTT。

3.根據(jù)權利要求2所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：反應液濃度為1mmol/LCdA、10mmol/L?UTP、10mmol/L?MgCl₂、20mmol/L?NaCl、20mmol/L?NaF、2mmol/L?DTT。

4.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的反應液用0.005～0.02mol/L的Tris-HCl(pH6.0～8.0)溶液定容。

5.根據(jù)權利要求4所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：定容液為0.01mol/L的Tris-HCl(pH7.4)。

6.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述的脫氧胞苷激酶(dCK)是指從小牛胸腺中提取的dCK。

7.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的反應是指37℃，150轉(zhuǎn)/min，反應2小時，冰浴10分鐘。

8.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述的步驟(2)中的層析條件是反相液相色譜柱為RESOURCE^TM?RPC?1ml，洗脫液A為0.05～0.02mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH6.0～8.0)，洗脫液B為乙腈，平衡為5～10個柱床，沖洗為5～7個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在10～20個柱床內(nèi)由0％線性增加至100％，流速為1～2ml。

9.根據(jù)權利要求8所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：洗脫液A為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，平衡為10個柱床，沖洗為7個柱床，洗脫梯度為洗脫液B在20個柱床內(nèi)由0％線性增加至100％，流速為1ml。

10.根據(jù)權利要求1所述的利用FPLC測定dCK的方法，其特征在于：所述的dCK酶活的計算方法：dCK酶活U＝CdA反應量(picomol)/蛋白含量(μg)·h，CdA反應量＝CdA空白標準量-CdA剩余量，CdA剩余量的測定為內(nèi)標法。