[發(fā)明專(zhuān)利]拉米夫定用藥評(píng)估試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710044699.1
• 申請(qǐng)日: 2007-08-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101363840A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮哲民;鄒祖燁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海主健生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/50
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/50;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)拉米夫定藥物敏感性的試劑盒。

背景技術(shù)

乙型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)乙型肝炎)是由乙型肝炎病毒(簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝病毒)引起的肝臟炎性損害，是我國(guó)當(dāng)前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種傳染病。臨床表現(xiàn)為乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、厭油、腹瀉及腹脹，部分病例有發(fā)熱、黃疸，約有半數(shù)患者起病隱匿。大部分乙型肝炎在急性期經(jīng)治后能痊愈，很多病例病程遷延或轉(zhuǎn)為慢性，其中一部分可發(fā)展為肝炎后肝硬變甚至肝癌；極少數(shù)病例病程發(fā)展迅猛，肝細(xì)胞出現(xiàn)大片壞死，成為重型肝炎；另有一些感染者則成為無(wú)癥狀的病毒攜帶者。

乙肝病毒是已知最小的部分雙鏈的環(huán)形DNA病毒，長(zhǎng)3.2kb，有高度重疊的4個(gè)基因區(qū)，編碼至少8種蛋白。即S基因編碼的大、中、小HBs；C基因的前C、HBc、HBe；P基因的聚合酶和X基因的HBx。乙肝病毒有高復(fù)制率和高突變率，高突變是由于基因組復(fù)制，需先轉(zhuǎn)錄為RNA中間體，但聚合酶缺乏校正功能所致。乙肝病毒這種高突變性造成乙肝病毒在診斷和治療是產(chǎn)生種種困難。

拉米夫定(Lamivudine，LAM，商品名為賀普丁))是當(dāng)前乙肝病毒治療廣泛應(yīng)用的核苷類(lèi)似物，它能顯著降低乙肝病毒DNA水平，并可使ALT正常化和肝組織改善。其作用機(jī)理是抑制乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

但在拉米夫定長(zhǎng)期治療中，乙肝病毒發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥。其機(jī)理是拉米夫定作用位點(diǎn)YMDD發(fā)生突變。YMDD變異包括第552位蛋基酸(M)，被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)所取代，即M552V與M552I(即rtM204VI變異)，兩者可單獨(dú)存在或混合存在，也可伴第528位亮氨酸(L)被蛋氨酸(M)所取代的變異，即L528M(即rtL180M)變異。野生株YMDD部位呈緩和口袋型，有利于核苷酸和拉米夫定結(jié)合，552位點(diǎn)的變異使側(cè)鏈變短，柔性降低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻，導(dǎo)致與拉米夫定三磷酸鹽的結(jié)合力下降，從而不可繼續(xù)合成HBV?DNA。

YMDD變異后，拉米夫定結(jié)合靶點(diǎn)失去了YMDD的正常基序，對(duì)該藥結(jié)合的敏感性大大降低，使拉米夫定對(duì)HBV前基因RNA逆轉(zhuǎn)錄及負(fù)鏈DNA復(fù)制為正鏈DNA的酶促過(guò)程不能抑制，從而造成耐藥。迅速及時(shí)的檢測(cè)乙肝病毒的YMDD突變，特別是能檢測(cè)少量YMDD突變，可以幫助醫(yī)生及時(shí)改變用藥，防止拉米呋啶出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，減少由YMDD突變株引起的癥狀?lèi)夯Ｍ瑫r(shí)，還能避免拉米夫定可能對(duì)患者造成的毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容

根據(jù)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心頒布的《中國(guó)人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對(duì)與拉米夫定藥物敏感性相關(guān)基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國(guó)人群適用性等進(jìn)行綜合分析評(píng)估后，確定檢測(cè)病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型可用于評(píng)估被檢者對(duì)拉米夫定藥物敏感性。

基于檢測(cè)病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型可用于評(píng)估被檢者對(duì)拉米夫定藥物敏感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)拉米夫定藥物敏感性的試劑盒。

該試劑盒包括：

檢測(cè)病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；

PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)；

PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、Exo?I酶、去離子水等)；

DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye?mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等)。

本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型，能特異性擴(kuò)增出包含YMDD區(qū)域的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類(lèi)引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。

本試劑盒中所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出YMDD區(qū)域基因型的DNA測(cè)序引物。設(shè)計(jì)這類(lèi)引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。DNA測(cè)序引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。

本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括：

1.PCR反應(yīng)套裝

10X?PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，

25mM?dNTP混合液0.2μl，

25mM?MgCl₂溶液1.5μl，

5units/μl?Taq?DNA聚合酶0.125μl，