[發(fā)明專利]一種分離純化β－葡萄糖苷酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710043571.3
• 申請日: 2007-07-06
• 公開（公告）號: CN101121929A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周珮;嚴(yán)欽;馮美卿;李幸慰;周偉
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離純化β-葡萄糖苷酶的新方法，具體涉及一種以微晶纖維素作為親和柱層析介質(zhì)，利用酶與底物的特異性吸附，高效純化β-葡萄糖苷酶的方法。

技術(shù)背景

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，也稱β-D-葡萄糖苷酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-葡萄糖苷酶存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、霉菌及細(xì)菌體內(nèi)，它參與生物體的糖代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。在食品工業(yè)中，常用β-葡萄糖苷酶來改善飲料、果酒及茶葉等的風(fēng)味，其機(jī)理是將某些風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)。在醫(yī)藥工業(yè)中，則利用β-葡萄糖苷酶的生物轉(zhuǎn)化功能，將某些廣泛存在的天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為在自然界稀有甚至不存在的藥物。如有研究利用特定的人參皂苷β-葡萄糖苷酶，能夠?qū)⒃谌藚⒅泻控S富的人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為具有抗腫瘤活性的Rg3、Rh2或CK等。因此，β-葡萄糖苷酶是一類極其重要的酶。然而，目前該類酶的分離純化過程仍局限一般的蛋白純化過程，拘泥于多種傳統(tǒng)柱色譜的組合應(yīng)用，如離子交換柱、疏水柱和分子篩柱等，純化步驟復(fù)雜且成本高，這已成為制約有關(guān)科學(xué)研究及其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸問題。因此，建立一種高效經(jīng)濟(jì)的純化方法是β-葡萄糖苷酶研究及應(yīng)用過程中一個(gè)迫切需要解決的重要問題。

微晶纖維素為天然纖維素經(jīng)稀酸水解并經(jīng)一系列處理后得到的極限聚合度的產(chǎn)物，它是一種無臭、無味、極細(xì)微的白色短棒狀或無定形結(jié)晶粉末，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、化工、農(nóng)業(yè)等各生產(chǎn)領(lǐng)域。微晶纖維素可作為健康食品的食用纖維，具有加強(qiáng)腸道蠕動(dòng)，預(yù)防動(dòng)脈硬化和吸附腸內(nèi)毒素等功能；微晶纖維素在冷凍食品中充當(dāng)物理性阻礙物，防止晶粒聚集在一起成為大的晶體；將微晶纖維素加在酸奶酪中可以一定程度避免乳清分離的現(xiàn)象，保證制品的穩(wěn)定性。在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)，微晶纖維素常常被用作藥品生產(chǎn)中的賦型劑和緩釋劑。然而，至今為止，未見有利用微晶纖維素來分離純化β-葡萄糖苷酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的分離純化β-葡萄糖苷酶的方法，該方法高效而經(jīng)濟(jì)。

本方法以微晶纖維素作為β-葡萄糖苷酶的親和柱層析介質(zhì)，在低溫和微酸性條件下，將β-葡萄糖苷酶上樣并特異性吸附于微晶纖維素柱，然后通過增加NaCl濃度的方法將該酶洗脫，實(shí)現(xiàn)高效并經(jīng)濟(jì)的分離純化β-葡萄糖苷酶。

微晶纖維素為葡萄糖的聚合體，作為的天然酶解底物，它在低溫和微酸性條件下能特異性的吸附β-葡萄糖苷酶，而這種吸附在高離子濃度條件下可以被解析。本發(fā)明微晶纖維素的特性，采用微晶纖維素作為β-葡萄糖苷酶的親和柱層析介質(zhì)，用于該類酶的高效純化，具有成本低和純化效率高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明方法包括下述步驟：

1、制備微晶纖維素層析柱：

將微晶纖維素(市購商品化產(chǎn)品)經(jīng)過表面活性洗滌劑處理，再用蒸餾水徹底沖洗干凈，除去其本身帶有的雜質(zhì)，然后裝柱，用不含NaCl的微酸性緩沖液充分平衡；

2、分離純化β-葡萄糖苷酶：用于分離純化的粗酶液先在平衡緩沖液中透析，然后上樣于已平衡好的微晶纖維素柱，用平衡緩沖液洗脫后，逐步增加緩沖液中的NaCl濃度，至目標(biāo)β-葡萄糖苷酶被洗脫下來；

3、產(chǎn)品純度鑒定：按常規(guī)方法收集具β-葡萄糖苷酶活性的部分，在SDS-PAGE蛋白膠上鑒定蛋白純度。

本發(fā)明方法在低溫(0-10℃)下進(jìn)行，優(yōu)選溫度為4-6℃。

本發(fā)明方法使用過的微晶纖維素柱，一般直接采用高濃度(0.8-1.0M)的NaCl溶液清洗后可重復(fù)使用；或用表面活性洗滌劑處理并用蒸餾水沖洗及高濃度(0.8-1.0M)的NaCl溶液清洗柱子后，重復(fù)使用。

本發(fā)明方法中，所采用的微晶纖維素在低溫和微酸性條件下，能特異性的吸附β-葡萄糖苷酶，同時(shí)可能非特異性的吸附其它雜蛋白。所述的非特異性吸附的雜蛋白在較低的NaCl濃度下能很容易的被洗脫，而特異性吸附的β-葡萄糖苷酶則需要較高濃度的NaCl溶液條件下才能被洗脫。因此，微晶纖維素作為親和層析介質(zhì)，在分離純化β-葡萄糖苷酶時(shí)具有分離過程簡單和純化效率高的優(yōu)點(diǎn)。

與現(xiàn)有技術(shù)的柱層析方法相比，本方法分離純化β-葡萄糖苷酶純化效率高，成本低廉。突出體現(xiàn)在：由于酶和底物的吸附具有選擇性高的特點(diǎn)，所以純化效率比一般的蛋白分離層析方法要高得多；同時(shí)，所采用的微晶纖維素是一種極經(jīng)濟(jì)易得的工業(yè)化材料，因此操作成本十分低廉。

附圖說明

圖1是實(shí)施例2的β-葡萄糖苷酶I的純化結(jié)果，其中，