[發明專利]一種高產核苷磷酸化酶的菌種及阿糖核苷的合成方法

無效

• 申請號: 200710043257.5
• 申請日: 2007-06-29
• 公開（公告）號: CN101113420A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 魏曉琨;丁慶豹;歐伶;閻蓬勃;邱蔚然
• 申請（專利權）人: 上海蔚平生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/40
• 代理公司: 上海東亞專利商標代理有限公司
• 代理人: 孔德力

技術領域

本發明屬于生化工程領域，具體涉及一種高產核苷磷酸化酶的菌種及應用該菌種酶法合成阿糖嘌呤類核苷的方法。

背景技術

阿糖嘌呤類核苷有阿糖腺苷，二氨基阿糖腺苷，阿糖肌苷等，其化學結構式如下。

阿糖腺苷???????????????????????二氨基阿糖腺苷?????????????????????阿糖肌苷

其中阿糖腺苷具有廣譜抗病毒的作用，對單純皰疹病毒I、II型、帶狀皰疹病毒的作用明顯，對腺病毒、EB病毒、牛痘病毒、巨細胞病毒及乙型肝炎病毒(HBV)等亦有抑制作用，對核糖核酸(RNA)病毒也有一定的抑制作用。臨床上可靜脈注射或外用。阿糖腺苷還是阿糖腺苷單磷酸重要中間體，而后者作為注射劑使用優勢明顯。二氨基阿糖腺苷和阿糖肌苷也有一定的抗病毒作用，更是昂貴的生化試劑，用于生化研究。

目前，阿糖嘌呤類核苷的制備可有下列方法：

1)發酵法

從Streptomyces?antibioticus發酵液中分離得到阿糖腺苷(Juichi?Awaya，Journal?ofantibiotics.1979，10：1050-1054)。此方法發酵單位低(幾十毫克每升發酵液)，提取困難，發酵周期長，且發酵液中混有其它化合物，不適合于大規模工業化生產。

2)化學合成法

化學合成方法有三類：(1)鹵代糖與嘌呤經保護、縮合、水解等反應制備。(2)半合成法：由木糖腺苷或核糖腺苷經-些反應使2′-羥基轉位。(3)全合成法：由D-阿拉伯糖經噁唑烷合成嘌呤糖苷。(1)法得到的是α和β構型的混合物，步驟長，收率低。(2)法反應步驟也長，且須經層分離。(3)法原料來源方便，步驟較短，特別是合成的產物具有立體專一的特點，而且從噁唑烷開始，反應的中間體不需分離。目前我國主要采用化學合成法生產阿糖腺苷。但是化學合成過程均需基團保護、脫保護反應、手性試劑和其它特殊防護，其工藝復雜、成本高、收率低(≤20％)、易造成環境污染。

3)酶化學合成法

先用化學法合成阿糖尿苷(Ara-U)或阿糖5-甲基尿苷(Ara-5MU)，再與嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)和尿苷磷酸化酶(UPase)的作用下，進行堿基和核糖基的交換反應。酶法合成阿糖嘌呤類核苷可用分離提純的酶或完整細胞進行催化。有許多文獻報道了酶法合成阿糖嘌呤類核苷，如文獻(Takashi?Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(4)：1053-1058；Takashi?Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(8)：2425-2430；Tskashi?Utagawa，Agric.Biol.Chem..1985，49(7)：2167-2171；鄭一敏，生物學雜志，2002，19(6)：20-21；郭勇莉，生物技術，2006，16(1)：32-35)。

這些酶化學法雖然有些可以獲得較高的收率，如90％以上，但是使用阿糖尿苷的量是嘌呤的三倍，浪費嚴重，且酶轉化時間長達24小時以上，酶反應難以控制等缺點。

發明內容

發明人為克服上述酶化學法合成阿糖嘌呤類核苷存在的酶轉化時間長達24小時以上，酶反應難以控制等技術缺陷，進行了廣泛的研究。最終提供一種產氣腸桿菌(Enterobacter?aerogenes)新菌種，該菌種具有高活力的嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，??應用該菌種為酶源制備嘌呤類阿糖核苷的方法。該方法應用阿糖尿苷或阿糖5-甲基尿苷為阿糖供體，摩爾轉化率最高可達90％以上，且酶反應時間大為縮短。大大增強了反應效率，降低了生產成本，適合于工業化生產。

本發明的構思是這樣的，以產氣腸桿菌完整細胞為酶源，主要利用嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，在微生物非增殖的情況下進行酶轉化生成阿糖嘌呤類核苷。

本發明所要解決的技術問題之一是提供一種產氣腸桿菌DWOQ-58，以提高嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力與產量。

本發明所要解決的技術問題之二是提供一種生產阿糖嘌呤類核苷的方法。