[發明專利]胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法

有效

• 申請號: 200710042044.0
• 申請日: 2007-06-15
• 公開（公告）號: CN101100655A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 張喜;張傳森
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁振英

1、一種胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法，其特征在于該方法包括：

I.胚胎源性多能干細胞的分離、培養、鑒定

采用全骨髓直接貼壁法獲得原代培養的細胞，然后按有限稀釋法進行克隆培養獲得該細胞的純化系，通過對CD133、SSEA-1、CD45、Oct-4和Nanog標記物的檢測進行鑒定；

II.胚胎源性多能干細胞向心臟起博細胞的誘導分化

向胚胎源性多能干細胞施加旁分泌因子、胞外基質組分層粘連蛋白、纖維連接蛋白，誘導胚胎源性多能干細胞分化為心臟起搏細胞。

2、根據權利要求1所述的胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法，其特征在于向胚胎源性多能干細胞施加旁分泌因子、胞外基質組分層粘連蛋白、纖維連接蛋白，同時轉染起搏基因HCN4，誘導胚胎源性多能干細胞分化為心臟起搏細胞。

3、根據權利要求1或2所述的胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法，其特征在于其中所述的旁分泌因子是內皮素-1或神經調節蛋白-1。

4、根據權利要求2所述的胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法，其特征在于II.胚胎源性多能干細胞向心臟起博細胞的誘導分化的具體步驟如下：

A)將Matrigel基質膠在4℃緩慢溶解，DMEM中稀釋1∶30，膠溶液800μl/孔涂于六孔板，37℃孵育2-3個小時，在培養細胞前棄掉膠溶液；

B)在上述六孔板中培養胚胎源性多能干細胞，接種密度為1-5×10⁵個/ml，加入旁分泌因子內皮素-1或神經調節蛋白-1，使其終濃度為10^-8M，連續培養4-7天；

C)Lipofect?MINE2000試劑輕柔搖勻，取10μl?LipofectMINE2000試劑在200μl?Opti-MEM中稀釋，室溫下溫育5min，將稀釋后的大鼠pEGFP-HCN4質粒基因與稀釋后的LipofectMINE2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。混合后在室溫下溫育20min，將上述混合液加入B中六孔板培養的細胞中，輕柔前后推搖培養板以混勻液體，然后將培養板送入細胞培養箱，37℃轉染4-6小時后，更換每孔不含LIF的胚胎源性多能干細胞培養基繼續培養，繼續培養直到48小時后，300ng/μl的G418加入到轉染后細胞中，篩選得到穩定的轉染HCN4的陽性克隆。

5、根據權利要求1所述的定向誘導分化的方法獲得的心臟起搏細胞在構建生物心臟起搏器中的應用。