[發明專利]胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法

有效

• 申請號: 200710042044.0
• 申請日: 2007-06-15
• 公開（公告）號: CN101100655A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發明（設計）人: 張喜;張傳森
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁振英

技術領域：

本發明涉及干細胞誘導分化技術領域，是利用胚胎源性多能干細胞進行誘導分化為心臟起搏細胞的方法及其應用。

背景技術：

構建生物心臟起搏器的方法可以分為基因治療和細胞移植兩種。以基因治療為基礎的方法是將特定的基因直接導入心臟來創建或提高其自動節律，然而，轉染起搏基因雖然提高和產生了心肌細胞的自律性，初步證明可以構建生物心臟起搏器，但依然面臨巨大的挑戰，如外源基因在體內缺乏長期穩定的表達并且難以有效的調控；不能得到高效、安全、導向性好的載體系統等。利用細胞移植的方法構建生物心臟起博器理論上可以克服上述基因治療的局限性，該方法是將具有起博活性的細胞移植到心臟，代替和修復宿主缺損的起博細胞，達到重新恢復心臟正常起搏能力的目的。但由于成體竇房結細胞供體來源困難，植入心臟后適應微環境的能力差，故目前細胞治療主要是以胚胎源性干/祖細胞和成體間充質干細胞作為細胞來源(Richard?B.Robinson，et?al.2006，If?and?the?biological?pacemaker)。然而由于缺少心肌細胞特異的離子電流，間充質干細胞較難誘導為起搏細胞，一般作為移植治療中攜帶基因的載體，嚴格意義上還屬于基因治療的范疇。胚胎源性干/祖細胞中，胚胎干細胞在誘導為具有起搏活性的細胞方面則較有優勢。目前已有報道從胚胎干細胞形成的類胚體中得到自發跳動的細胞，并將這些細胞移植到心臟的特定區域構建起搏器；結果表明移植區有自主心律，并對神經性調節有自動反應性。但是，胚胎干細胞來源的起搏細胞具有向終末成熟心肌細胞分化的性質，而一旦分化為終末細胞則失去起搏特性，因此精確控制干細胞分化并終止于竇房結細胞階段是一個難題。此外胚胎干細胞存在免疫原性、致瘤性、倫理道德等問題也是阻礙其應用的重要因素。

胚胎源性多能干細胞是存在于骨髓中的一種與胚胎干(ES)細胞近似的干細胞群，表達ES特征性的表面標志，具有強大的增殖能力和多向分化潛能(Kucia?M，et?al.2007，Morphological?and?molecularcharacterization?of?novel?population?of?CXCR4⁺SSEA-4⁺Oct-4⁺verysmall?embryonic-like?cells?purified?from?human?cord?blood)。至今未見利用該細胞定向誘導分化心臟起搏細胞構建生物心臟起搏器的相關報道。

發明內容：

本發明的目的是利用胚胎源性多能干細胞定向誘導分化心臟起搏細胞，用于生物心臟起搏器的構建。

本發明的關鍵在于如何誘導胚胎源性多能干細胞分化為具有穩定活性的起搏細胞，如何精確控制干細胞分化并終止于竇房結細胞階段。

根據早期胚胎心臟發育過程中起搏細胞的分化條件(多種微環境條件和關鍵基因)的研究，內皮素-1和神經調節蛋白-l等旁分泌因子是心臟早期起搏細胞分化成熟的微環境條件之一(Dirk?L.Brutsaert.2002，Cardiac?Endothelial-Myocardial?Signaling：Its?Role?in?CardiacGrowth，Contractile?Performance，and?Rhythmicity.Stacey?Rentschler，etal.2002，Neuregulin-1?promotes?formation?of?the?murine?cardiacconduction?system)。除了旁分泌信號促發作用外，在誘導干/祖細胞向起搏細胞方向分化的過程中，胞外基質組分是需要考慮的一個重要因素(Baharvand?H，et?al.2005，The?effect?of?extracellular?matrix?onembryonic?stem?cell-derived?cardiomyocytes)。此外，心臟三個起搏基因HCN1、HCN2、HCN4中，在起搏細胞中主要存在的是HCN4，在起搏細胞的發育分化成熟中HCN4起重要作用(Juliane?Stieber，et?al.2003，Thehyperpolarization-activated?channel?HCN4?is?required?for?the?generation?ofpacemaker?action?potentials?in?the?embryonic?heart)。

鑒于上述情況，本發明提供一種胚胎源性多能干細胞向心臟起搏細胞定向誘導分化的方法，該方法包括：