[發明專利]高同源度多基因家族的表達譜的構建方法

有效

• 申請號: 200710041192.0
• 申請日: 2007-05-24
• 公開（公告）號: CN101096667A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發明（設計）人: 宋任濤;馮玲娜;朱佳;王剛;許政暟
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C40B50/06
• 代理公司: 上海上大專利事務所
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及一種多基因家族表達譜的構建方法，特別是一種高同源度的多基因家族表達譜的構建方法。

背景技術

多基因家族是一類起源于共同的祖先的基因，并因此具有相同的功能和相似的DNA序列。在大腸桿菌(E.coli)的基因中，已知的基因家族成員超過了50％(Kooninet?al.，1998)，而在真核生物中這個比例甚至有可能更高(Chervitz?et?al.，1998；Sempleand?Wolfe，1999)。在植物基因組中，多基因家族更是一個特征。例如，有66％的擬南芥(A.thaliana)基因屬于基因家族，并且其中一半的家族有至少五個成員基因(Analysisof?the?genome?sequence?of?the?flowering?plant?Arabidopsis?thaliana，2000)，而這種情況在其他植物中普遍存在。研究一個基因家族中所有基因對于獲得這個基因家族總體功能的正確認識是十分必需的。

傳統上，研究多基因家族表達譜多用northern?blotting和半定量PCR。但是當基因家族的大小超過10個基因時，由于要制備許多特異性的雜交，使得northern?blotting變成相當乏味和重復的工作(Dong?et?al.，2003)。并且，northern?blot技術檢測表達量十分低的基因比較困難(Brown?et?al.，2003；Jakab?et?al.，2003)。多基因家族的成員通常在序列上都是十分相似的以至于在northern?blot過程中很容易出現交叉雜交(cross-hybridize)的現象(Montrichard?et?al.，2003)，因此，它很難確定一個基因家族的特定的一個成員表達情況。半定量PCR是通過普通PCR后進行凝膠電泳的條帶亮度來確定表達的高低，這是一種粗略定量的方法，對于表達量十分低的基因來說這種方法不足以確定其表達情況。

為了能夠解決這樣的問題，本領域迫切需要使用新的研究方法來進行高同源度的多基因家族的表達調控研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高同源度的多基因家族表達譜的構建方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種高同源度多基因家族的表達譜的構建方法，其特征在于該方法用于構建多基因家族所包含的各個基因家族的表達譜，具體步驟為：從多基因家族基因的表達部位提取總RNA，該總RNA經變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析和定量；再以各個樣品點的總RNA為模板，以Oligo(dT)₁₆作引物進行反轉錄，得到反轉錄產物；根據表達的基因序列對多基因家族所包含的各個基因家族分別設計引物，以所述的反轉錄產物為模板，進行實時熒光定量PCR；以Actin作為內參基因，數據由軟件Opticon3.1進行采集和分析，即可分別得到多基因家族中所包含的各個基因家族在各個樣品點上的絕對表達量，從而進一步獲得其表達譜。

一種高同源度多基因家族所包含的各個基因家族的各成員基因的的構建方法，其特征在于該方法用于構建多基因家族所包含的各個基因家族的各成員基因的表達譜，具體步驟為：

i.從所要檢測的部位提取組織的總RNA，該總RNA經變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析和定量，再以各個樣品點的總RNA為模板，Oligo(dT)₁₆作引物進行反轉錄，得到反轉錄產物；

ii.分別比對各基因家族內所有同源基因的序列，在保守區設計引物，并且擴增片段中包含有多態性的比較位點；利用所述的引物，以步驟a

得到的反轉錄產物為模板進行PCR擴增，擴增所使用的循環數處于擴增線性區，從而得到擴增產物；

iii.通過T-A克隆法，將步驟b得到的擴增產物克隆到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，涂布含有氨卞青霉素的LB平板，37℃，培養14小時，根據藍白斑篩選，隨機挑取轉化子，將該轉化子在37℃，250rpm條件下，液體培養14小時；再大規模提取該轉化子的DNA，采用通用引物M13Reverse?Primer，雙脫氧法(DYEnamicET-Terminator?Cycle?Sequencing)，對所得質粒進行測序；所得到的序列經phred/phrap程序(ewing?et?al.，1998)分析，分別得到各個樣品點上，各成員基因的表達狀態及其在所屬的基因家族中相對表達豐度；

iv.將各個樣品點上的多基因家族所包含的各個基因家族的絕對表達量與其所包含的各個成員基因的相對豐度相結合，即可獲得各個成員基因的表達譜。