[發明專利]高同源度多基因家族的表達譜的構建方法

有效

• 申請號: 200710041192.0
• 申請日: 2007-05-24
• 公開（公告）號: CN101096667A
• 公開（公告）日: 2008-01-02
• 發明（設計）人: 宋任濤;馮玲娜;朱佳;王剛;許政暟
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C40B50/06
• 代理公司: 上海上大專利事務所
• 代理人: 何文欣

1.一種高同源度多基因家族的表達譜的構建方法，其特征在于該方法用于構建多基因家族所包含的各個基因家族的表達譜，具體步驟為：從多基因家族基因的表達部位提取該基因家族的總RNA，該總RNA經變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析和定量；再以各個樣品點的總RNA為模板，Oligo(dT)₁₆作引物進行反轉錄，得到反轉錄產物；根據表達的基因序列對多基因家族所包含的各個基因家族分別設計引物，以所述的反轉錄產物為模板，進行實時熒光定量PCR；以Actin作為內參基因，數據由軟件Opticon3.1進行采集和分析，即可分別得到多基因家族所包含的各個基因家族在其表達過程中的表達譜。

2.一種高同源度多基因家族所包含的各個基因家族的各成員基因的表達譜的構建方法，其特征在于該方法用于構建多基因家族所包含的各個基因家族的各成員基因的表達譜，具體步驟為：

a.從多基因家族基因的表達部位提取該組織的總RNA，該總RNA經變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析和定量，再以各個樣品點的總RNA為模板，Oligo(dT)₁₆作引物進行反轉錄，得到反轉錄產物；

b.分別比對各基因家族內所有同源基因的序列，在保守區設計引物，并且擴增片段中包含有多態性的比較位點；利用所述的引物，以步驟a得到的反轉錄產物為模板進行PCR擴增，擴增所使用的循環數在擴增的線性區內，得到擴增產物；

c.通過T-A克隆法，將步驟b得到的擴增產物克隆到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，涂布含有氨卞青霉素的LB平板，37℃，培養14小時，根據藍白斑篩選，隨機挑取轉化子，將該轉化子在37℃，250rpm條件下，液體培養14小時；再大規模提取該轉化子的DNA，采用通用引物M13?Reverse?Primer，雙脫氧法，對所得質粒進行測序；所得到的序列經phred/phrap程序分析，分別得到各基因家族中各成員基因的表達狀態及其相對豐度；

d.將多基因家族所包含的各個基因家族在各個樣品點上的絕對表達量與其所包含的各個成員基因的相對豐度相結合，即可獲得各個成員基因的表達譜。