[發(fā)明專利]一種抗體親和層析純化溶葡萄球菌酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710040561.4
• 申請(qǐng)日: 2007-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101302504A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃晉江;張繼恩;黃青山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/36
• 分類號(hào): C12N9/36
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶的純化方法，具體的說(shuō)涉及溶葡萄球菌酶的層析純 化方法。

背景技術(shù)

溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是Staphylococus?Simulans葡萄球菌分泌于胞 外的蛋白產(chǎn)物，分子量為27kDa，含246個(gè)氨基酸，是一種肽鏈內(nèi)切酶。 該酶可切斷葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽鍵橋結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到迅 速溶解并殺死細(xì)菌的目的。即使是耐藥性金黃色葡萄球菌，MRSA及“超級(jí) 細(xì)菌”，溶葡萄球菌酶也同樣有很強(qiáng)的殺菌作用，而且不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥 菌株，有望成為治療耐藥性細(xì)菌感染的新型生物制劑。

1987年復(fù)旦大學(xué)在球形芽孢桿菌中表達(dá)溶葡萄球菌酶獲得成功，并建 立了該酶的分離純化方法，該方法包括使用DEAE纖維素的陰離子層析以 及CM纖維素的陽(yáng)離子層析，由于層析介質(zhì)剛性弱、蛋白載量低，導(dǎo)致層 析過(guò)程流速不能太快、只能處理小體積樣品，處理10升樣品需要4天的時(shí) 間，而且在得率、純度等方面都不理想。

申請(qǐng)人構(gòu)建了一種從含溶葡萄球菌酶基因的球形芽孢桿菌培養(yǎng)上清中 純化溶葡萄球菌酶的技術(shù)(專利公開(kāi)號(hào)：CN1743453；公開(kāi)日：2006.3.8)， 該方法包括離子交換和疏水層析，處理45升樣品只需2個(gè)工作日，總回收 率為50％，比活性達(dá)到1000U/mg蛋白質(zhì)，但此方法只適用于工業(yè)化的大 生產(chǎn)，生產(chǎn)所得的溶葡萄球菌酶純度達(dá)到90％左右，尚不能滿足藥用的純 度要求。

另外，申請(qǐng)人構(gòu)建了一種用大腸桿菌高效外分泌表達(dá)溶葡萄球菌酶的 工藝(專利公開(kāi)號(hào)：CN1900290；公開(kāi)日：2007.1.24)，符合新藥申報(bào)的藥 用工程菌的要求，表達(dá)產(chǎn)物以最終的成熟溶葡萄球菌酶活性形式存在于培 養(yǎng)基中，無(wú)包涵體復(fù)性等步驟；純化較簡(jiǎn)單，宿主菌蛋白污染少；回收率 高，表達(dá)量可以達(dá)到200-400mg/L，回收率大于60％，但所得的溶葡萄球菌 酶純度也無(wú)法達(dá)到藥用的要求，需要更進(jìn)一步的純化。

親和層析法是依據(jù)生物大分子能夠與配體特異、可逆地結(jié)合在一起的 特性，從復(fù)雜的生物樣品中分離得到所需目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化方法。它基 于生物大分子與配體之間的生物學(xué)特異性，具有選擇性強(qiáng)、純化效率高、 步驟簡(jiǎn)單，為近年來(lái)各類蛋白純化的主要研究方向，部分研究者也嘗試用 親和層析法純化溶葡萄球菌酶：如用Sepharose4B作為親和吸附劑，用金 黃色葡萄球菌的死菌體細(xì)胞和細(xì)胞壁肽聚糖作為配體進(jìn)行的親和層析(張 培德，馬力，陳石根.葡萄球菌酶的親和層析.工業(yè)微生物，1992，21(5)：1-5)。 有采用殼聚糖作為載體，與酶作用的特異底物(細(xì)菌菌體細(xì)胞)固定化，作為 吸附介質(zhì)純化溶葡萄球酶(周毅彬，張培德.工業(yè)微生物.2002，332(1)： 19-22)。也有以金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖(PG)偶聯(lián)于BrCN活化的 Sepharose4B為親和吸附介質(zhì)用以純化溶葡萄球菌酶(張培德，馬力.工業(yè)微 生物.1992，5:1-5)。但以菌體細(xì)胞或細(xì)胞壁肽聚糖作為配體制得的親和吸附 柱柱效很短，使用2—3次后就基本喪失親和作用，且吸附量較低，無(wú)法應(yīng) 用于工業(yè)化生產(chǎn)。

因此尋找一種專一性好、產(chǎn)品純度高、樣品吸附量大的溶葡萄球菌酶 純化工藝是有關(guān)領(lǐng)域十分迫切需要解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種抗體親和層析純化溶葡萄球菌 酶的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。

本發(fā)明的方法包括如下步驟：

(1)溶葡萄球菌酶抗體的處理：

將含有溶葡萄球菌酶抗體的樣品通過(guò)預(yù)先用0.05～0.2mol/L?pH7.0-9.0 的緩沖液A平衡好的裝有protein?A樹(shù)脂的層析柱，然后用0.05～0.2mol/L pH7.0-9.0的緩沖液A清洗上樣后的protein?A層析柱；再用0.05～0.2mol/L pH2.0～4.0的緩沖液B以每分鐘1～4ml的流速，將溶葡萄球菌酶抗體從層析 柱上洗脫并收集洗脫峰，凍干，獲得溶葡萄球菌酶抗體凍干產(chǎn)物；

含有溶葡萄球菌酶抗體的樣品中，溶葡萄球菌酶抗體的含量為0.1～3 ％，每ml的protein?A樹(shù)脂可以純化1-50mg的溶葡萄球菌酶抗體樣品。

所說(shuō)的溶葡萄球菌酶抗體樣品的制備方法參照公開(kāi)出版物[(美)J.薩 姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版).第十 八章，第一節(jié)，PP853-858.科學(xué)出版社.1992]；