[發明專利]抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法

無效

• 申請號: 200710040471.5
• 申請日: 2007-05-10
• 公開（公告）號: CN101062413A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 劉永德;唐峰;葉陳梁;汪毅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;C07K16/08;A61P31/14
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;張宗明

技術領域

本發明涉及一種生物制劑的制備方法，具體是一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法。用于生物工程領域。

背景技術

犬細小病毒(Canine?parvovirus，CPV)性腸炎是犬最常見的傳染病之一，其發病率與死亡率高達50％～100％，嚴重影響犬的健康。近年來，隨著城鄉肉用犬及寵物犬飼養數量的增加，該病的發病率呈上升趨勢。目前對患病犬一般采用對癥和支持治療，治愈率很低，尤其是對2～3月齡幼犬效果更差。有報道用犬、馬、兔、豬、驢等動物制作抗病毒血清，將提純的犬細小病毒性腸炎免疫球蛋白注射液用于治療患病犬。自1992年Yokoyama等發現卵黃抗體能治療仔豬大腸桿菌性腹瀉以來，卵黃抗體已廣泛應用于消化道疾病的防治中。卵黃中的IgY耐消化道屏障，性質穩定。

經對現有技術的文獻檢索發現，王玉燕等在《中國預防獸醫學報》(2003年第25卷第3期)發表的“抗CAD、CAV卵黃抗體的制備”一文，該研究用CDV、CAV分別免疫產蛋雞，收集雞蛋，用海藻酸鈉-硫酸銨法提取卵黃抗體(IgY)，并對提取的IgY采用了SDS-PAGE和低壓層析檢測純度，用間接ELISA測定提取的IgY的活性。但是該方法需對卵黃抗體進行多步提純后使用，制備工藝繁瑣，成本高且IgY的活性損失較大。

發明內容

本發明針對現有技術的不足和缺陷，自制疫苗，在強化免疫的基礎上，提供一種抗犬細小病毒卵黃抗體生物制劑的制備方法，使其建立抗犬細小病毒抗體效價評定依據，將具有生物活性的卵黃抗體制備成無副作用的能直接飲用的口服生物制劑或利于保存的粉劑，該制劑也可作為寵物保健品或生物制藥的原料。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

步驟一，采集診斷為細小病毒感染的病死犬的腸道及內容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm離心60分鐘去除微小顆粒；

步驟二，按去除微小顆粒后的上清液總體積的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質；

步驟三，取去除脂溶性物質后的上清液，按其總體積的10％加入用體積百分比濃度為2.5％戊二醛醛化、洗滌后的豬紅細胞，搖勻4℃放置2小時進行病毒吸附，離心沉淀豬紅細胞，用體積比為4％的鹽水配成體積比10％的紅細胞懸液，37℃放置2小時進行病毒釋放，離心去除豬紅細胞，取病毒釋放液，釋放液中的病毒HA效價達1∶4096有效；

步驟四，取上述病毒釋放液經甲醛滅活后加入褐藻多糖，使每毫升液體含4毫克，制備成油乳劑疫苗，即犬細小病毒疫苗；將制備的犬細小病毒疫苗免疫20周齡以上經產母雞后，用血凝抑制試驗(HI)進行效價測定，當卵黃中HI效價達1∶256以上時收集免疫卵，效價低于1∶128時進行第三次免疫；

步驟五，收獲卵黃用無菌蒸餾水對倍稀釋，用乳酸液調pH4.4進行酸處理去除雜蛋白、-40℃凍融處理2次去除脂質，抽濾液經35％飽和硫酸銨鹽析、除鹽后即可獲得IgY，稀釋封裝在安培瓶中，放65℃水浴箱處理20分鐘，經口服安全性檢驗、微生物檢驗合格后即成安全的口服生物制劑，其IgY的得率達95％以上，活性不受任何影響，5毫升卵黃混合液中提取后可獲得IgY26毫克以上，一個免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。本發明制得的制劑噴霧干燥成粉劑后IgY的活性不變。

本發明的基本原理是利用家禽作為生物反應器生產各類生物活性物質。當供試雞免疫后即產生特異性抗體，血液中的抗體逐漸進入卵黃并蓄積。該抗體穩定，經口服后能抵抗胃酸的破壞，活性物質封閉胃腸中的特異性病原入侵受體或直接中和特異性病原體或毒素，從而達到預防和治療的目的。

與現有技術相比，本發明的有益效益是：感染細小病毒的病犬，可直接口服生物制劑替代其他生物制劑的注射治療，幼犬臨床治愈率高達95％以上，也可添加于寵物保健品中口服，可預防幼犬感染細小病毒。該方法成本低，見效快，一個免疫蛋一般可得70-100毫克的IgY。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1

犬細小病毒野毒采集：取診斷為細小病毒感染的病死犬的腸道及內容物按重量比1∶1加生理鹽水研磨，離心去除沉渣，上清液20000rpm高速離心60分鐘去除微小顆粒。

病毒初提：按上清液總量的10％加入氯仿，劇烈振蕩，離心去除脂溶性物質。