[發明專利]一種含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制備菊粉外切酶的方法

有效

• 申請號: 200710040392.4
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101063089A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 呂紅;李育陽;袁漢英
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N9/24
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 姚靜芳

技術領域

本發明屬于遺傳工程和發酵工程領域，具體涉及含有菊粉酶基因的鷹嘴豆克 魯維酵母基因工程菌株，以及用該基因工程菌株制備菊粉外切酶的方法。

背景技術

菊粉(Inulinase)(Edelman，J.and?T.G.Jefford.1964.The?metabolism of?fructose?polymers?in?plants.4.Beta-fructofuranosidases?of?tubers?of Helianthus?tuberosus?L.Biochem.J?93：148-161)，又稱菊糖，分布在菊科、 龍膽科、桔梗科等植物中，特別是菊芋的塊莖中含量豐富。菊粉是由6-60個呋喃 構形的D-果糖經β-2，1-糖苷鍵脫水聚合，兩端再各連接一個分子葡萄糖而形成 的多聚物。菊粉外切酶(2，1-β-D-fructan?fructanohydrolase?EC3.2.1.7)能 水解β-2，1-D-果聚糖果糖糖苷鍵，將菊粉水解成單糖。

菊粉酶在以下方面有重要的應用前景。第一方面，是高果糖漿的制備。高果 糖漿是理想的天然甜味劑，果糖的甜度比蔗糖高出80％；它在肝臟中磷酸化后能 直接進入三羧酸循環，不像葡萄糖那樣受到胰島素的控制，也能適合糖尿病人食 用，有望成為替代蔗糖的新一代甜味劑。同時還具有營養保健功能，能調節腸胃、 提高免疫力、排毒養顏、降解血糖和抗癌等等，被稱為第三代功能食品。傳統的 高果糖漿的制備是以淀粉為原料，在淀粉酶的作用下水解成葡萄糖，再在異構酶 的作用下將葡萄糖異構成果糖，這種方式生產的高果糖漿中果糖的含量不足50％， 并且果糖和葡萄糖分離難，成本高；新型的生物酶法生產高果糖漿，是以菊粉為 原料，一步生物酶反應，即可獲得果糖含量高于90％的高果糖漿，工藝簡單，產 量高。但高活性的菊粉酶是制備高果糖漿的關鍵。第二方面，是生物能源領域的 應用。目前，生物乙醇的生產主要是以玉米淀粉為原料，原料的種植面臨與人用 糧食爭奪土地的尷尬。菊芋的主要成分菊粉，它的生長條件粗狂，種植可不占用 耕地，不僅能生長鹽堿地，還能生長在荒漠地區，能防止土地沙化，以菊粉為原 料生產生物乙醇可以成為目前淀粉乙醇的補充和后備方法。菊粉在菊粉酶的作用 下，水解成單糖，能直接被酵母利用，產生乙醇。因此，菊粉酶的生產成本直接 影響了菊粉乙醇的成本，是用菊粉做原料制備乙醇的關鍵。

菊粉酶來源非常廣泛，據不完全統計，產菊粉酶的有絲狀真菌17個屬50余 種，酵母菌10個屬20余種，細菌12個屬10余種(Pandey，A.，C.R.Soccol， P.Selvakumar，V.T.Soccol，N.Krieger，and?J.D.Fontana.1999.Recent developments?in?microbial?inulinases.Its?production，properties，and industrial?applications.Appl.Biochem.Biotechnol.81：35-52)。但具有 生產價值的菊粉酶的生產，一般選用馴化過的菊粉酶產生菌，如曲霉、克魯維酵 母等；也可以通過基因工程菌的方法。后者因經過基因工程改造，使菊粉酶的產 量更高，因此更具競爭性。但目前已經報道的基因工程菌生產的菊粉酶，主要是 用嗜甲醇的畢赤酵母表達系統生產(王建華，王明華等，2004，一種外切菊粉酶 的生產方法，中國發明專利CN1495252A)，這種制備菊粉酶的方法，需要甲醇誘 導表達，生產出的菊粉酶在制備食品級高果糖漿的應用中受到限制；另一方面， 這種制備方法，發酵原料成分復雜，發酵時間長，發酵產生的酶產量依然低下， 使得生產菊粉酶的成本較高。

發明內容

本發明的目的之一是獲得一種組成型表達的菊粉外切酶鷹嘴豆克魯維酵母 基因工程菌株，從而避免在發酵過程中在培養基中添加甲醇，并降低生產成本。

本發明的另一個目的就是獲得一種由所述基因工程菌發酵生產菊粉酶的方 法。

本發明提供了一種含有菊粉外切酶(即菊粉酶，NCBI登陸號為AF178979) 基因序列的基因工程菌株，即采用基因工程方法將菊粉外切酶基因克隆到真核表 達載體pUKDS上，并轉化鷹嘴豆克魯維酵母Y179U(CCTCC?No：M202031)，從而 構建獲得組成型表達的菊粉外切酶克魯維酵母基因工程菌株。