[發(fā)明專利]一種抗人Nogo－66受體蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710039666.8
• 申請(qǐng)日: 2007-04-19
• 公開（公告）號(hào): CN101288771A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸佩華;于盼盼;黃立東;徐曉明;虞志華;王艷霞;王小飛;劉欣秋;徐亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): A61K39/395
• 分類號(hào): A61K39/395;A61P25/00;C12N15/09;C12N15/12
• 代理公司: 上海翼勝專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 翟羽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白疫苗的制備，尤其涉及抗人Nogo-66受體(NgR)蛋白疫苗的制備方法及其在脊髓損傷修復(fù)治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前已發(fā)現(xiàn)的來源于髓鞘的軸突再生抑制分子主要有三種：Nogo-A，MAG和OMgp。這三種分子結(jié)構(gòu)明顯不同的蛋白質(zhì)卻有著一個(gè)共同的受體，即Nogo-66受體(NgR)。NgR能夠以高親和力與這三種抑制分子結(jié)合，并將其抑制軸突再生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。

研究者曾使用脊髓勻漿或髓鞘提取物免疫動(dòng)物來治療脊髓損傷(SpinalCord?Injury，SCI)，結(jié)果表明，免疫后的機(jī)體可通過產(chǎn)生抗抑制分子的抗體來封閉其抑制作用，由此促進(jìn)動(dòng)物損傷脊髓的功能恢復(fù)。但是，脊髓勻漿或髓鞘提取物中的成分相當(dāng)復(fù)雜，除了含有上述三種抑制分子外，還包括許多其它成分。用它們來免疫動(dòng)物，有誘發(fā)自身免疫病的危險(xiǎn)，較理想的方案是使用幾個(gè)抑制分子或用它們的受體作為免疫原。Sicotte等用聯(lián)合使用重組的Nogo-66和MAG分子的片段作為免疫原免疫動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生。也有實(shí)驗(yàn)室將幾個(gè)抑制分子的基因片段串聯(lián)至一個(gè)重組質(zhì)粒中構(gòu)建成DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)也能在一定程度上促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。但是，用其受體NgR作為免疫原，目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明中制備抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的方法如下所述。

從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)hNgR基因(不包含信號(hào)肽)。所用引物如下：

上游引物：5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；

下游引物：5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；

其中上游引物含BamHI位點(diǎn)，下游引物含HindIII位點(diǎn)和終止密碼子。將擴(kuò)增的片段插入至克隆載體pUC19中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后再亞克隆至含6個(gè)His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET28a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NgR。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS-PAGE和Western?Blot對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行鑒定。最后，采用Ni-NTA親合純化系統(tǒng)(申能博彩公司)純化出目的蛋白，并通過SDS-PAGE分析鑒定。

重組質(zhì)粒pET28-hNgR的雙酶切鑒定(BamH?I和HindIII)和PCR鑒定結(jié)果均顯示，插入片斷與預(yù)先設(shè)計(jì)一致(圖1A)，DNA測(cè)序則進(jìn)一步證明插入位點(diǎn)及序列完全正確。隨后，重組質(zhì)粒pET28-hNgR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，該質(zhì)粒可在大腸桿菌種表達(dá)一分子量為50KD左右的蛋白，與目的蛋白的預(yù)期分子量一致；用抗His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Westen?Blot鑒定，則進(jìn)一步證明該條帶即為帶有6×His標(biāo)簽的hNgR融合蛋白。最終通過Ni-NTA親和純化系統(tǒng)純化，成功獲得了免疫動(dòng)物所需的且純度較高的hNgR蛋白(圖1B，圖1C)。本發(fā)明中抗人NgR蛋白疫苗可以在制備治療或預(yù)防脊髓損傷的藥中加以應(yīng)用，也可以在制備治療或預(yù)防肢體癱瘓的藥中加以應(yīng)用。

本發(fā)明所公開的抗NgR蛋白疫苗可以通過封閉NgR，阻斷抑制因子的作用，從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元軸突的再生，減輕損傷區(qū)的組織壞死，促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)，其避免了外源性生物制劑，比較容易被自身免疫系統(tǒng)清除的缺點(diǎn)，另外也克服了針對(duì)NgR的DNA疫苗接種后主要誘發(fā)細(xì)胞免疫，只有少數(shù)個(gè)體能誘導(dǎo)出體液免疫的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1A是重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hNgR的雙酶切及PCR鑒定結(jié)果圖，其中M1，M2：DNA分子參照標(biāo)準(zhǔn)，1：質(zhì)粒pET28a-hNgR經(jīng)BamH?I和HindIII酶切后電泳圖，2：質(zhì)粒pET28a-hNgR的PCR電泳結(jié)果；

圖1B是重組NgR蛋白的原核表達(dá)和純化的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，3：經(jīng)純化的重組NgR蛋白；

圖1C是重組NgR蛋白的Western?Blot鑒定結(jié)果圖，其中1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白；

圖2是ELISA法檢測(cè)大鼠血清中的抗NgR抗體結(jié)果圖；

圖3是免疫組化檢測(cè)進(jìn)入損傷脊髓組織中的抗NgR抗體結(jié)果圖；