[發明專利]一種純化的高比活的重組巴曲酶

有效

• 申請號: 200710038911.3
• 申請日: 2007-03-30
• 公開（公告）號: CN101275126A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 黃秀東;陳佩新;潘學工;王強;曹之舫
• 申請（專利權）人: 上海萬興生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;A61K38/48;A61P7/04;C12N9/74
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及遺傳工程領域，尤其涉及純化的高比活的重組巴曲酶及其應用。

背景技術

早在1936年奧地利學者Van?Klobusitzky等就從巴西矛頭蛇(Bothrops?atrox)的毒液中純化精制出一種酶性止血劑Batroxobin，在國內最早的中譯名稱之為“巴曲酶”。巴曲酶屬于絲氨酸蛋白酶類分子，其分子的生理功能及分子的大小均有類似凝血酶(Thrombin)之處，故稍后也有稱之為“血凝酶”。但隨著對它的深入研究，國內外對巴曲酶在不同的時期賦予了不同的含義。巴西矛頭蛇(Bothrops?atrox)有5個亞種，從有的亞種提取的巴曲酶具有止血功效[1]，而從另一些亞種中提取的巴曲酶卻具有去除纖維蛋白原的作用，蛇種的差別，導致了習慣上籠稱的“巴曲酶”的蛋白質，事實上在其生物化學本質上是完全不同的：有的是止血功效為主，有的則是降纖作用為主，至于這種化學本質上的不同是源于氨基酸序列上的差別或是由于糖基等蛋白質修飾上的差別還有待進一步研究考察。

目前只有從蛇毒中提取制備的巴曲酶用于治療多種臨床適應癥(如，心肌梗死、老年癡呆、中風、突發性耳聾等等)的專利(US?Pat.No：5595974，5869044，6106830，6399576，6416717；Eur.Pat.No：0984279，0826374，0750912，0719791)和研究報告，還沒有重組巴曲酶用于動物試驗和臨床研究工作的任何相關研究報導。從蛇毒中生物提取的巴曲酶主要來自巴西矛頭蛇(Bothropsmoojeni，Bothrops?atrox)的毒液中，含量很低，其原料的獲得以及天然巴曲酶純品的獲得難度大，往往還會在終產品中殘留少量蛇的毒素以及許多不明雜質，給臨床使用帶來潛在的風險。高度純化后的天然巴曲酶的理論分子量應該也是25.6kDa，但實際上該蛋白在毒蛇的毒腺細胞中分泌表達是發生了糖基化修飾，實際分子量37-43kDa，這種分子量有一范圍的原因或是糖基化修飾程度上有差別，也有純化手段不同而導致的糖鏈丟失等原因所引起。從蛇毒中提取制備的天然巴曲酶，由于蛇毒原料的來源受養蛇的規模、四季節變化等因素影響，其質量控制是很困難，產品的比活性也很不穩定。

對巴曲酶這種來自蛇毒的蛋白質分子生物學研究一直進展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的cDNA和基因組DNA測序工作。1991年日本藤澤制藥公司(Fujisawa?Pharmaceutical)的研究者采用基因重組方法，在E.coli中，采用融合表達系統，以包涵體(InclusionBody)的形式表達出該成分，再通過制備電泳和凝血酶切割開融合蛋白的方法得到所謂有生物學活性巴曲酶，而且還為此申請了專利(Pat.No.：JP2124092，1990)。采用基因工程的手段生產富含二硫鍵的蛋白一直都是一個技術難題，尤其是生產有多對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶類分子。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然日本藤澤制藥公司報道了通過對包涵體的變性-復性能得到有活性的目的蛋白，但是其比活低，重現性差，直到現在也未見該公司有重組巴曲酶產品問世。

因此，本領域迫切需要一種不受季節限制，生產規模容易控制的重組的巴曲酶產品，它具有極高的二硫鍵配對正確率，而且活性高。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種基因重組的巴曲酶。

本發明的第二個目的是提供所述基因重組的巴曲酶的用途。

本發明的第三個目的是提供含有所述基因重組的巴曲酶的藥物組合物。

在本發明的第一方面，提供了一種純化的重組巴曲酶，所述的巴曲酶具有以下特性：

(a)分子量為29-32kDa；

(b)所述重組巴曲酶中至少90％(≥90％)巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對：Cys⁷-Cys¹³⁹，Cys²⁶-Cys⁴²，Cys⁷⁴-Cys²³⁰，Cys¹¹⁸-Cys¹⁸⁴，Cys¹⁵⁰-Cys¹⁶³和Cys1¹⁷⁴-Cys¹⁹⁹；

(c)在SEQ?IDNO：1中第146位和第225位被N-型糖基化修飾；和

(d)所述巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白。

在另一優選例中，所述重組巴曲酶中至少95％具有正確的6對二硫鍵配對。