[發明專利]基因或核酸序列的酶切－連接長序列半合成方法

無效

• 申請號: 200710038807.4
• 申請日: 2007-03-30
• 公開（公告）號: CN101275163A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 赫英俊;肖愛軍;周磊;邵永勝
• 申請（專利權）人: 上海捷瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34;C07H21/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 胡美強

技術領域

本發明涉及一種核酸序列，尤其涉及一種特定長核酸序列的獲得方法。

背景技術

在生命科學及醫學研究中，特定核酸(如全基因或復雜脫氧核糖核酸)序列的獲得已經成為一種必不可少的過程。目前其獲得特定序列的途徑主要有反轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR法)和化學合成法兩種。

前者的基本原理是：設計特異性引物，用目標生物的核糖核酸或脫氧核糖核酸為模板，進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR反應)，擴增得到目標序列，能夠得到的序長度一般在1500個堿基對以下。

化學法是用人工合成互補引物，然后應用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增得到目的片段，一般能夠得到序列的長度一般在3000個堿基對以下，此外，化學合成序列的錯誤率與所合成序列的長度呈正相關。所以，如何得到10000個堿基對或以上的長片段基因或復雜脫氧核糖核酸序列一直是困擾基因和基因組研究，特別是關于一些長度較大的重要功能基因研究的問題。

如何克服上述缺陷是科技技術人員要解決的問題。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供了一種基因或核酸序列的酶切-連接長序列半合成方法，旨在解決上述的問題。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下步驟實現的：

目標基因或核酸序列分析：對要求合成或獲得的目標序列進行分析，設計分段化學合成的片段長度、分割位點；

目標基因或核酸序列的片段化學合成：根據上述分析的結果，用化學合成法合成目標基因或脫氧核糖核酸序列的片段，在合成時人為引入適當的限制性內切酶識別位點；

目標基因或核酸序列各片段的限制性酶切反應：用能夠識別上述位點的限制性內切酶進行酶切反應，產生含有粘性末端的片段；

目標基因或核酸序列各片段的正確連接：用適當連接酶對分段合成的基因或核酸序列的片段進行常規的酶促連接反應。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：可獲得10000個堿基對，目前最長達到13000堿基對；并且錯誤率低、成本也低。

附圖說明

圖1是本發明以限制性內切酶BpiI的一個實施例。請按照提示修改

具體實施方式

下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細描述：

由圖1可見：

目標基因或核酸序列分析：對要求合成或獲得的目標序列進行分析，設計分段化學合成的片段長度、分割位點，以避免片段中含有不適當的限制性內切酶識別位點，以及達到片段的大小適合化學合成、錯誤率最小和成本最低之目的；最重要的是：在化學合成前進行精確設計，使得各片段左右兩端的粘性末端均不相同，以保證各片段能夠按照設計的順序正確連接。設計時將目標基因或合算序列分為3段進行化學合成，其中有2個擬利用的區段，即NNNNNN/OOOOOO區段和RRRRRR/QQQQQQ區段，其中，N、O、R、Q為任意堿基，但必須符合以下原則：

a)N與O是互補配對堿基，R和Q是互補配對堿基；

b)NNNNNN/OOOOOO區段和RRRRRR/QQQQQQ區段不完全一致；

目標基因或核酸序列的片段化學合成：根據上述分析的結果，用化學合成法合成目標基因或脫氧核糖核酸序列的片段(如圖1中的化學合成片段1、2、3等)，在合成時人為引入適當的限制性內切酶識別位點(如圖1中的BpiI限制性內切酶識別位點，用箭頭表示)；

目標基因或核酸序列各片段的限制性酶切反應：用能夠識別上述位點的限制性內切酶進行酶切反應，產生含有粘性末端的片段(圖1中含有粘性末端的片段1、2、3等)；

目標基因或核酸序列各片段的正確連接：用適當連接酶對分段合成的基因或核酸序列的片段進行常規的酶促連接反應。由于在化學合成前的精確設計，使得各片段左右兩端的粘性末端均不相同，以保證各片段能夠按照設計的順序正確連接。以圖1為例：由于N與O是互補配對堿基，R和Q是互補配對堿基，所以含有粘性末端的片段1(含有粘性末端OOOO)和含有粘性末端的片段2(含有粘性末端NNNN)能夠正確連接，而含有粘性末端的片段2的另一端同時還含有粘性末端QQQQ，但由于粘性末端QQQQ與片段1的粘性末端OOOO不配對，所以含有粘性末端的片段2不可能反向連接在片段1上。其余片段的連接類推。最后，即可得到按照設計正確連接的目的基因或核酸的全長序列。