[發明專利]一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 200710037850.9
• 申請日: 2007-03-06
• 公開（公告）號: CN101235350A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 趙慶節;沈根祥;梁丹濤;胡雙慶;郭春霞;顧海蓉;錢曉雍;黃麗華;周?；?/a>
• 申請（專利權）人: 上海市環境科學研究院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 杜林雪

技術領域

本發明涉及一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其制備方法，用于變性梯度凝膠電泳分析土壤細菌多樣性的DNA樣品的制備，屬于DNA分析技術領域。

背景技術

目前，變性梯度凝膠電泳是使用最為廣泛的土壤細菌多樣性分析方法，用于變性梯度凝膠電泳的DNA樣品制備過程包括土壤總DNA的提取、純化以及目標DNA的擴增。然而土壤DNA提取和純化工藝復雜，途徑多樣，擴增難度大，制備過程費時費力，結果可比性差。

發明內容

本發明的發明目的是為了提供一種土壤DNA樣品制備試劑盒及其制備方法，以克服現有DNA樣品制備工藝復雜、難度大、費時費力的問題。

本發明的發明目的可以通過以下技術方案來實現。

一種土壤DNA樣品制備試劑盒，包括盒體和隔板；盛有溶液I的試劑瓶A，盛有溶液II的試劑瓶B，盛有溶液III的試劑瓶C，盛有溶液IV的試劑瓶D，盛有懸液V的試劑瓶E，內含酸洗玻璃珠的離心管F，微型過濾器G，PCR(鏈式聚合酶反應)管H。

其中，溶液I為120mmol/l的磷酸鹽緩沖液；溶液II的配比組成為Tris·HCl(三羥甲基氨基甲烷·鹽酸)10mmol/l，EDTA(乙二胺四乙酸)1mmol/l，CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)0.2％，pH8.0；溶液III為5mol/l的醋酸銨；溶液IV為異丙醇(純品)；懸液V的配比組成是Sephadex?G752％(質量體積比)；酸洗玻璃珠0.5g，直徑約0.2mm；PCR管H的體積為200μl，內盛有DNA引物各0.25μmol，Taq酶2U，4種dNTP(脫氧核糖核酸)各200μmol，1×PCR反應緩沖液100ul，冷凍干燥所得。

離心管F為2ml的離心管。

所有試劑與耗材均經無菌處理。

所述的異丙醇保存在棕色試劑瓶中。

土壤DNA樣品制備步驟如下：

a)選擇用于實驗的環境土壤樣品；

b)將用于步驟a)中的農田土壤經細胞裂解液裂解后，獲得土壤中的所有微生物的基因組DNA；

c)將步驟b)獲得的基因組DNA純化后作為PCR擴增的模板；

d)選擇一般用于原核生物16SrRNA(16S核糖體核糖核酸)基因擴增的通用引物對；

e)在步驟d)選擇的通用引物對的正向引物的一端加上GC發卡結構；

f)按照設計的PCR反應條件進行PCR擴增；

g)將步驟f)所述的PCR擴增產物作為樣品保存備用。

通過本發明技術方案設計而成的試劑盒，具有使用簡便、結果穩定，可有效地節省使用者時間和成本的優點。

附圖說明

圖1為試劑盒組成示意圖；

圖2為試劑盒操作步驟示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖與具體實施例進一步闡述本發明的技術特點。

1.稱取待處理的干燥分散(如含水量高，10000g離心2分鐘，取沉淀物備用)土壤樣品0.5g的至離心管F中，加入1ml溶液I(A)，輕微旋渦震蕩混勻，2000g離心1～2min，去除上清液，重復操作一次；

2.取800ul溶液II(B)(注：如果溶液II凝固，請置于60℃水浴中加熱溶解)至離心管F中，劇烈旋渦震蕩2～5分鐘，10000g離心1～2分鐘；

3.移取上清液400ul至潔凈無菌的1.5ml離心管(自備)中，加入400ul溶液III(C)，4℃保溫20分鐘，10000g離心5～10分鐘；

4.盡量吸取上清液至2ml離心管中(自備)，加入800ul溶液IV(D)，顛倒混合均勻，-20℃保溫20分鐘，10000g離心5～10分鐘；

5.棄上清液，加入200ul?TE(Tris-EDTA)溶液(或無菌水)懸浮沉淀物，得溶液②；

6.移取溶液②至凝膠過濾柱①中，1000g離心1分鐘，得到濾液③；

7.加入98ul無菌超純水至PCR管(H)中，加入2ul溶液③，蓋緊蓋子(注：如果所用PCR儀沒有熱蓋，再添加10ul無菌液體石蠟)；

8.將PCR管(H)放入PCR儀中，反應溫度循環設置如下：(1)94℃變性10分鐘；(2)以下是10個循環，94℃變性1分鐘，65℃～55℃復性1分鐘，復性溫度每個循環降低1℃，72℃延長1分鐘；(3)以下是20個循環，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘；(4)72℃延長8分鐘，4℃保溫。

9.得到DNA樣品④備用，-20℃保存。