[發明專利]光高粱的檢測引物及檢測方法

無效

• 申請號: 200710037576.5
• 申請日: 2007-02-15
• 公開（公告）號: CN101245372A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 印麗萍;易建平;王偉
• 申請（專利權）人: 印麗萍
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發明屬于農業植物檢驗檢疫技術領域，具體地涉及一種利用分子生物學檢測技術快速準確地檢測光高粱的檢測方法以及用于該方法的檢測引物，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等領域使用。

(二)背景技術

光高粱(Sorghum.nitidum(Vahl)Pers)是世界十大惡性雜草假高粱的近似種，光高粱最早發現于印度西部，后傳播到東南亞、印度尼西亞、澳大利亞等國。光高粱為多年生，且產生根莖，其形態和染色體大小與假高粱相似。Y.Sun等(1994)曾認為光高粱應歸入Sorghum區組，而DeWet(1978)，Guo(1996)等則建議將其并入Parasorghum中，近似種的存在為口岸檢疫準確快速鑒定假高粱增加了困難。

實際工作中，農產品中夾雜的假高粱等雜草種子的外觀特征往往會因運輸受到磨損與變型，同時由于環境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同等引起的個體差異，更為形態鑒定增加了難度，而細胞生物學方法等不僅需要較長的周期，而且僅依據染色體的形態仍難以鑒定。

(三)發明內容

技術問題

本發明的目的在于克服上述現有技術中關于形態鑒定和細胞生物學方法存在的困難，提出采用分子生物學方法，針對核糖體序列設計光高粱的特異性引物，建立光高粱PCR檢測方法，以達到快速準確檢測鑒定的目的。

技術方案

目前，未見有光高粱的PCR方法鑒定報道，本引物是針對光高粱的rDNA的內轉錄間隔區序列設計的。18S～26S核核糖體DNA(nrDNA)的內轉錄間隔區ITS被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分。ITS區在植物核基因組中是高度重復的。全部nrDNA重復單位包括4萬個拷貝以串聯重復(tandemrepeats)方式出現在一個或多個染色體基因位點上(Regers?&?Bendich?1987，綜述見Hamby?&?Zimmer1992)。在被子植物中，ITS區既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性，說明這些間隔區的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如屬間、種間)解決植物系統發育問題。屈良鵠和陳月琴(1999)通過對不同生物類群的ITS序列(自生物學數據庫)的比較得出：被子植物大多數科屬的ITS序列的種間差異值為1.2％～10.2％，屬間差異值為9.6％～28.8％，這對系統發育研究來說都是較合適的范圍。

本發明的重點是用于檢測光高粱的引物N3/N5以及所述的引物序列的完全互補鏈。針對光高粱ITS序列的特異性位點差異，設計了檢測光高粱引物N3/N5，建立了光高粱種子的PCR檢測技術。

光高粱PCR的檢測方法，包括。

檢測過程如下：

1種子DNA獲取

單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取：

1)液氮中碾種子于1.5mL離心管中，加入500μL?TES，TES由100mM?Tris(pH8.0)，10mM?EDTA，2％SDS組成；

2)加7μL蛋白酶K混勻，置于55℃水浴60～120min，期間混勻幾次；

3)調節鹽濃度至1.4M，加1/10體積的10％十六烷三甲基溴化銨，置于65℃水浴10min；

4)加入等體積的SEVGA混勻，SEVGA為氯仿∶異戊醇＝24∶1，不能太劇烈，以保證DNA的完整性，0℃孵育30min；

5)4℃13,000r/min離心10min，取上清夜至1.5mL離心管中；

6)加225μL?5M醋酸銨混勻，0℃孵育30min以上，4℃13,000r/min離心2min；

7)取上清，加入3μL核糖核酸酶A，37℃水浴30min，以去除RNA；

8)加0.55體積的預冷異丙醇，-20℃放置30min以上；

9)4℃13,000r/min離心15～20min，棄異丙醇，70％乙醇洗2次。室溫干燥，50μLTE或雙蒸水溶解，TE為10mM?Tris，1mM?EDTA(pH8.0)。

2PCR擴增