[發(fā)明專(zhuān)利]光高粱的檢測(cè)引物及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710037576.5
• 申請(qǐng)日: 2007-02-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101245372A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 印麗萍;易建平;王偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 印麗萍
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.?一種用于光高粱檢測(cè)的特異性引物對(duì)的上游引物，其DNA序列是5’-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3’。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物序列的完全互補(bǔ)鏈。

3.?一種用于光高粱檢測(cè)的特異性引物對(duì)，其特征在于：該引物對(duì)DNA序列為：上游引物N3：5’-GGCGTCAAGGAACACTTATA-3’；下游引物N5：5’-ACGTCCCTCCTCCCCTCT-3’。

4.?一種利用PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)光高粱種子的檢測(cè)方法，其特征是利用如權(quán)利要求3所述的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5.?如權(quán)利要求4所述的一種用于光高粱檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征是檢測(cè)過(guò)程包括如下步驟：

(1)種子DNA獲取；(2)PCR擴(kuò)增；(3)瓊脂糖凝膠電泳。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于光高粱檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征是步驟(2)中PCR反應(yīng)總體積為30μl，其中包含：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl、KCl、MgCl₂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、引物和Taq?DNA聚合酶；加雙蒸水至終體積為30μl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

7.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于光高粱檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征是步驟中(3)中取擴(kuò)增產(chǎn)物加入緩沖液，混勻，進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳。

8.?根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于光高粱檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征是步驟(3)中擴(kuò)增產(chǎn)物為10μL，緩沖液是0.25％溴酚蘭，質(zhì)量體積百分含量40％(W/V)蔗糖水溶液。

9.?一種用于光高粱檢測(cè)的檢測(cè)方法，其特征是檢測(cè)過(guò)程包括如下步驟：

(1)種子DNA獲取

單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取：

(a)液氮中碾種子于1.5mL離心管中，加入500μLTES，TES由100mM?Tris，pH＝8.0，10mM?EDTA，2％SDS組成；

(b)加7μL蛋白酶K混勻，置于55℃水浴60～120min，期間混勻幾次；

(c)調(diào)節(jié)鹽濃度至1.4M，加1/10體積的10％十六烷三甲基溴化銨，置于65℃水浴10min；

(d)加入等體積的SEVGA混勻，SEVGA為氯仿∶異戊醇＝24∶1，不能太劇烈，以保證DNA的完整性，0℃孵育30min；

(e)4℃13,000r/min離心10min，取上清夜至1.5mL離心管中；

(f)加225μL?5M醋酸銨混勻，0℃孵育30min以上，4℃13,000r/min離心2min；

(g)取上清，加入3μL核糖核酸酶A，37℃水浴30min，以去除RNA；

(h)加0.55體積的預(yù)冷異丙醇，-20℃放置30min以上；

(i)4℃13,000r/min離心15～20min，棄異丙醇，70％乙醇洗2次，室溫干燥，50μLTE或雙蒸水溶解，TE為10mM?Tris，1mM?EDTA，pH＝8.0；

(2)PCR擴(kuò)增；

利用引物N3/N5：進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為30μl，包含：10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl、50mmol/L并且pH為8.3的KCl、1.5mmol/L?MgCl₂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP濃度為100μmol/L、引物濃度為100nmol/L；Taq?DNA聚合酶為0.5U；加雙蒸水至終體積為30μl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃3min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；

(3)瓊脂糖凝膠電泳

取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，加入3μL上樣緩沖液混勻，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后于凝膠成像儀中成像存盤(pán)，其中緩沖液是0.25％溴酚蘭，質(zhì)量體積百分含量40％(W/V)蔗糖水溶液。

10.?根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的引物在用于光高粱檢測(cè)中的用途。

11.?根據(jù)權(quán)利要求4-9任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測(cè)方法在用于光高粱檢測(cè)中的用途。