[發明專利]適用于生產穩定性同位素15N標記L－亮氨酸的發酵生產工藝

有效

• 申請號: 200710037054.5
• 申請日: 2007-02-01
• 公開（公告）號: CN101235402A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 張亮;杜曉寧;李良君;趙誠
• 申請（專利權）人: 上海化工研究院
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12R1/13;C12R1/15
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙志遠

1.?適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟：

(1)出發菌株的選取

選取適用于L-亮氨酸-¹⁵N生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌、谷氨酸棒桿菌；

(2)發酵培養配方

以全合成培養基為基本培養基，添加少量有機氮源，以葡萄糖為碳源，初始配方中葡萄糖濃度為6～14wt％；以氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等銨鹽或尿素為初始氮源，發酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節pH來補充氮源，不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解液、菌體水解液等有機氮源的一種，該有機氮源中氨基氮濃度為5～20g/L；磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽、亞鐵鹽等無機鹽根據不同菌種添加一定量；發酵初始配方中生物素大大過量，VB1添加50～2000ug/L，VB6添加50～1000ug/L，泛酸添加50～500ug/L，尼克酸添加20～600ug/L；

(3)發酵工藝

根據產品需求量分別采用搖瓶發酵或發酵罐發酵工藝得發酵液；

所述的搖瓶發酵是將菌體接種于活化培養基平板上，30℃下生化培養箱中培養16～30小時，待菌落長成后，將菌體接種于事先滅菌完的發酵培養液中，每瓶發酵培養液接一環菌體，發酵培養液的裝液量為裝液瓶的3wt％～5wt％，將接種完的發酵培養液置于搖擺式搖床上，發酵溫度28～32℃，搖床轉速180～240轉/分鐘，連續發酵72～96小時；

所述的發酵罐發酵是將菌體接種于活化培養基平板上，30℃下生化培養箱中培養16～30小時，待菌落長成后，將長好的菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養基的搖瓶中，在28～32℃下搖床培養10～24小時，獲得種子液；發酵初始溫度28～33℃，初始pH6.8～7.2，采用大接種量2～10wt％、低糖流加，強制控制發酵工藝，將種子按體積比2～10％接種于已滅菌的裝有發酵培養基的發酵罐中開始發酵，控制條件：溫度29～37℃，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.01～0.05MP，溶解氧1～95％，PH7.0～7.5，采用添加液氨方式控制發酵液PH值，并以消泡劑消泡。

(4)分離提取

發酵液中¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸的分離采用離子交換法提取得到¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸溶液，通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。

2.?根據權利要求1所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中的培養基包括斜面保藏培養基、斜面活化培養基、種子培養基、發酵培養基。

3.?根據權利要求2所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的斜面保藏培養基的配方為：蛋白胨：10g/l，牛肉膏：3g/l，氯化鈉：5g/l，瓊脂：20g/l。

4.?根據權利要求2所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的斜面活化培養基的配方為：葡萄糖：3g/l，蛋白胨：10g/l，牛肉膏：10g/l，氯化鈉：5g/l，瓊脂：20g/l。

5.?根據權利要求2所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的種子培養基的配方為：葡萄糖：30g/l，尿素：1g/l，硫酸銨：5g/l，KH₂PO₄：0.5g/l，玉米槳：20g/l，MgSO₄.7H₂O：5mg/L。

6.?根據權利要求1所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中有機氮源的添加量為0.2wt％以下。

7.?根據權利要求1所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中發酵初始配方中生物素大大過量，添加純生物素100～1000ug/L。

8.?根據權利要求1所述的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，所述的步驟(3)中發酵罐發酵全過程控制pH在微堿性，pH用添加液氨控制在7.0～7.5，流加50wt％葡萄糖控制發酵液葡萄糖濃度3～6wt％，發酵時間32～70小時。