[發明專利]適用于生產穩定性同位素15N標記L－亮氨酸的發酵生產工藝

有效

• 申請號: 200710037054.5
• 申請日: 2007-02-01
• 公開（公告）號: CN101235402A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 張亮;杜曉寧;李良君;趙誠
• 申請（專利權）人: 上海化工研究院
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12R1/13;C12R1/15
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙志遠

技術領域

本發明屬于穩定性同位素標記化合物生產領域，涉及到微生物發酵生產工藝，尤其涉及適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝。

背景技術

¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸的生產可采用有機合成法、前體發酵法、酶法及提取法、直接發酵法等。采用合成法工藝繁瑣，且需要光學拆分使¹⁵N原料利用率比較低，成本上升。水解法常用于制備復合氨基酸，要分開所有氨基酸很困難。酶法生產L-亮氨酸-¹⁵N需要α-氧代己酸、甲酸銨-¹⁵N作為原料，最終產量不是很高，原料甲酸銨-¹⁵N利用率較低。而采用直接發酵法生產，目標氨基酸大量富集，分離比較簡單，但由于種子、發酵配方中有機氮源很難標記，常常使L-亮氨酸-¹⁵N的豐度下降很多達不到產品要求，篩選適用于L-亮氨酸-¹⁵N生產的工藝條件是該技術的關鍵。而且采用常規發酵方法，¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸產量雖然相對較高，但¹⁵N豐度下降很大，往往下降3％以上，很難達到高豐度產品要求。且由于要添加大量¹⁵N無機氮源，成本很高。采用全合成培養基發酵雖然對¹⁵N豐度影響不大，但產酸量太低使得¹⁵N原料利用率不高。目前，在¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸的生產領域中還不見專利和文獻報道。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的不足之處而提供一種¹⁵N-L-亮氨酸豐度高，¹⁵N利用率高的適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

適用于生產穩定性同位素¹⁵N標記L-亮氨酸的發酵生產工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟：

(1)出發菌株的選取

選取適用于L-亮氨酸-¹⁵N生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌、谷氨酸棒桿菌；

(2)發酵培養配方

以全合成培養基為基本培養基，添加少量有機氮源，以葡萄糖為碳源，初始配方中葡萄糖濃度為6～14wt％；以氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等銨鹽或尿素為初始氮源，發酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節pH來補充氮源，不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解液、菌體水解液等有機氮源的一種，該有機氮源中氨基氮濃度為5～20g/L；磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽、亞鐵鹽等無機鹽根據不同菌種添加一定量；發酵初始配方中生物素大大過量，VB1添加50～2000ug/L，VB6添加50～1000ug/L，泛酸添加50～500ug/L，尼克酸添加20～600ug/L；

(3)發酵工藝

根據產品需求量分別采用搖瓶發酵或發酵罐發酵工藝得發酵液；

所述的搖瓶發酵是將菌體接種于活化培養基平板上，30℃下生化培養箱中培養16～30小時，待菌落長成后，將菌體接種于事先滅菌完的發酵培養液中，每瓶發酵培養液接一環菌體，發酵培養液的裝液量為裝液瓶的3wt％～5wt％，將接種完的發酵培養液置于搖擺式搖床上，發酵溫度28～32℃，搖床轉速180～240轉/分鐘，連續發酵72～96小時；

所述的發酵罐發酵是將菌體接種于活化培養基平板上，30℃下生化培養箱中培養16～30小時，待菌落長成后，將長好的菌苔接種于已滅菌的裝有種子培養基的搖瓶中，在28～32℃下搖床培養10～24小時，獲得種子液；發酵初始溫度28～33℃，初始pH6.8～7.2，采用大接種量2～10wt％、低糖流加，強制控制發酵工藝，將種子按體積比2～10％接種于已滅菌的裝有發酵培養基的發酵罐中開始發酵，控制條件：溫度29～37℃，通氣量0.5～1.5VVM，罐壓0.01～0.05MP，溶解氧1～95％，PH7.0～7.5，采用添加液氨方式控制發酵液PH值，并以消泡劑消泡。

(4)分離提取

發酵液中¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸的分離采用離子交換法提取得到¹⁵N穩定性同位素標記L-亮氨酸溶液，通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。